研究背景:胰腺癌被称为“癌中之王”,早期诊断困难、缺乏有效药物。尽管传统基因组、转录组和表观遗传研究鉴定了胰腺癌关键突变基因和异常的信号通路,但研究成果未能成功转化到临床应用的原因之一是胰腺癌异质性强。传统的批量测序技术只能测得组织细胞的混杂信息,无法进一步探究胰腺癌肿瘤细胞特性,难以明确诊疗靶点。单细胞测序技术能从单个细胞层面上探究肿瘤细胞。已有研究利用单细胞测序技术解析头颈部癌、肝癌等肿瘤微环境和间质细胞功能。由于胰腺组织富含消化酶,胰腺组织单细胞分离仍是开展胰腺癌单细胞研究的限速步骤。研究目的:摸索构建适用于多种胰腺肿瘤组织和正常胰腺组织的单细胞分离技术,结合单细胞转录组织测序技术构建完整的胰腺肿瘤单细胞研究方法。并将此方法应用于胰腺癌异质性解析和治疗靶点挖掘。研究方法:本研究首先检测了单细胞分离新方法分离多种类型胰腺肿瘤和正常胰腺组织单细胞样本的得率和活率,并对基于此方法获得的单细胞样本转录组数据的质量控制分析。随后我们利用本方法对胰腺癌织进行单细胞转录组测序,鉴定胰腺癌组织中的细胞类群。通过染色体拷贝数变异分析和差异表达基因通路富集分析鉴定恶性细胞。针对肿瘤恶性细胞进一步分群分析鉴定恶性细胞亚群和功能。最后我们基于胰腺癌单细胞转录组数据,探究IL-17通路和NOTCH通路在胰腺癌组织恶性细胞中的活化状态,在细胞系和小鼠模型上验证IL-17通路和NOTCH通路对胰腺癌细胞增殖、迁移等功能影响。进一步通过体外实验探究IL-17通路与NOTCH通路之间的调控关系。最后在皮下成瘤小鼠模型上探究共同抑制IL-17通路与NOTCH通路对于肿瘤生长的影响。研究结果:我们构建了一套适用于多种胰腺组织和正常胰腺组织的单细胞分离方法,提升了胰腺癌组织单细胞得率,保存了正常胰腺组织单细胞样本活率。利用此方法获得的单细胞样本经单细胞转录组建库测序后,得到的各样本数据之间在质量上具有可比性。基于此,我们绘制了胰腺癌单细胞转录组图谱,发现胰腺癌组织包含Ⅰ型导管细胞、Ⅱ型导管细胞、腺泡细胞等10种类型细胞类群。Ⅱ型导管细胞具有较高的染色质变异水平,高表达肿瘤特性相关基因,被鉴定为恶性细胞。我们进一步将Ⅱ型导管细胞分为7个细胞亚群,各个细胞亚群分别特异性表达迁移、增殖等功能相关基因。高表达增殖相关基因的Ⅱ型导管细胞亚群在胰腺癌病人中的占比不一。根据增殖亚群相关基因的表达水平可以将胰腺癌病人分为3个类群,生存分析显示高表达增殖亚群相关基因的胰腺癌病人预后较差。基因互作网络分析鉴定出了增殖细胞亚群中处于核心调控地位的CDK1,PLK1和AURKA基因,体外抑制这些基因可以抑制胰腺癌细胞增殖。基于胰腺癌单细胞转录组的分析发现胰腺癌组织部分恶性细胞上调IL-17相关信号通路和NOTCH信号通路,体内外实验验证了 IL-17和NOTCH可分别促进胰腺癌肿瘤细胞功能和发生发展,机制分析证明了 IL-17通过NFκB通路激活NOTCH通路。在皮下成瘤小鼠模型中,共同抑制IL-17通路和NOTCH信号通路组肿瘤的生长速度明显慢于单独抑制IL-17通路或NOTCH信号通路。研究结论:1.本研究开发的单细胞分离方法可获得高质量的胰腺组织单细胞样本,用于单细胞转录组测序可得到质量具有可比性的数据用于胰腺肿瘤研究;2.胰腺癌组织中有10种类型细胞,其中的Ⅱ型导管细胞是恶性细胞,它由多个功能不同的细胞亚群组成,具有很强的异质性;3.胰腺癌恶性细胞种包含增殖相关细胞亚群,发现高表达增殖亚群基因的胰腺癌病人预后不良,调控增殖特性的CDK1,PLK1和AURKA是胰腺癌的潜在治疗靶点;4.IL-17通路和NOTCH信号通路可协同促进胰腺癌发生发展,共同抑制两条通路可以限制肿瘤生长,增强药物治疗胰腺癌效果。