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目的意义：随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，NK细胞在造血干细胞／骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注。供者异源反应性NK细胞在异基因造血干细胞移植中可以发挥移植物抗白血病(graft-versus-leukemia，GVL)效应，并减少移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)的发生；在实体瘤(如肾细胞癌、黑色素瘤)也有裂解肿瘤细胞的抗实体瘤作用。故输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植及抗肿瘤辅助治疗的新策略。但外周血中NK细胞含量少(约占淋巴细胞的5--7％)，且目前尚缺乏有效的高纯度的体外扩增体系，所以广泛的临床应用受到了限制。本研究目的在于探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的方法，并对扩增后NK细胞功能进行评价，以期筛选出有效的NK细胞体外扩增方法，为进一步的临床应用奠定基础。材料和方法：先采用miniMACS免疫磁珠阴性分选方法，从外周血单个核细胞(PBMNC)得到纯化的NK细胞，随后在干细胞培养基条件下，通过IL2、IL12和IL15等细胞因子的不同组合分为IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组和对照组，分别培养15天，每3-4天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后(CD3-CD56+)NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞功能的变化。对其功能的检测从以下三方面进行：(1)在不同效靶比下对靶细胞的杀伤作用；(2)用ELISA方法检测培养液上清中IFN-γ的分泌水平；(3)建立竞争性RT-PCR方法定量检测穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达水平。结果：(1)经miniMACS阴性免疫磁珠分选后(CD3-CD56+)NK细胞含量由分选前的11.19±5.25％提高到94.23±3.50％。培养15天后除对照组(CD3-CD56+)NK细胞纯度略下降外，其余四组与扩增前无显著性差异(P＞0.05)。(2)在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培养体系中，NK细胞扩增倍数分别为15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和53.95±6.72，均显著高于对照组6.14±1.0(P＜0.01)，但IL2+IL15与IL2+IL15+IL12组间未见显著差异(P＞0.05)。(3)各组扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤率均较扩增前增强，在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+IL12组对K562细胞的杀伤率显著高于其他组，但两组间无显著性差异(P＞0.05)。(4)各细胞因子组培养液中IFN-γ分泌水平均显著高于未加细胞因子的空白对照组(P＜0.01)，且在不同细胞因子条件下，IFN-γ分泌水平呈IL2+IL12+IL15组＞IL2+IL12组＞IL2+IL15组＞IL2组(P＜0.01)(5)各组扩增的NK细胞Perforin及GranzymeB基因的表达量均较扩增前明显增加(P＜0.01)，且IL2+IL15组、IL2+IL12+IL15组两种基因的表达量均显著高于其他组(P＜0.01)，但组间差别较小，与NK细胞杀伤实验的结果相一致。结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量NK细胞后，应用IL2+IL15培养条件是获得纯度高、细胞毒活性强、扩增效率高的NK细胞的简单有效方法。