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氢气作为一种理想的可替代能源,具有燃烧热值高、清洁、可再生等优势,其开发与利用受到广泛关注。在众多产氢有机体中,由于绿藻氢酶活性高、培养条件简单、生长速度快等,绿藻产氢被视为最具应用前景的生物制氢途径。本研究以单细胞真核绿藻——莱茵衣藻为材料,构建了FNR沉默藻株amiR-FNR,在此基础上建立其蓝光诱导调控FNR表达系统,获得工程藻株amiR-FNR-B并应用于衣藻持续制氢研究,具体研究结果如下:第一部分内容是利用ami RNA技术,构建FNR沉默载体pDp124-amiR-FNR,该载体使用PsaD基因的启动子启动amiRNA表达,带巴龙霉素抗性标签,通过珠磨法转化入莱茵衣藻CC-849,筛选并验证获得转化子amiR-FNR。qPCR结果显示,相比于野生型CC-849,amiR-FNR的FNR表达量下调了32%,至此,成功获得FNR缺陷藻株。气相色谱结果显示amiR-FNR 7天的总产氢量是野生型的5倍;利用Phyto-PAM检测藻细胞叶绿素荧光参数,结果显示amiR-FNR的最大光合效率（Fv/Fm）比野生型下调了12.8%,实际光合效率（Yield）下调了16.4%,相对电子传递速率（ETR）下调了16.4%,光化学淬灭参数（qP）下调了25.6%,表明敲降FNR影响了衣藻光合效率;气相色谱结果显示培养瓶中amiR-FNR顶空氧气占比量比野生型CC-849显著性偏低,最低仅为9.1%,比野生型低了41%;qPCR结果显示,相比于野生型,amiR-FNR的氢酶编码基因HydA1的相对表达量提高了84%,HydA2提高了75%;铁氧还原酶（Fd）的亚基Fdx5表达水平相较于野生型提高了16.76倍,表明amiR-FNR细胞内形成了厌氧环境,诱导了Fdx5高表达,Fd的电子接收中心PetF相对表达量提高了87%,说明敲降FNR有利于提高电子从Fd传向氢酶的活性,促进衣藻产氢;检测了细胞对数期前期的淀粉含量,结果显示,amiR-FNR较野生型的淀粉量多了42%,表明敲降FNR有利于衣藻前期淀粉的积累,利于衣藻通过分解淀粉产生电子的间接途径,为H2合成提供底物。为了回补ami R-FNR的光合效率以调控衣藻产氢,第二部分内容是在FNR缺陷藻株的基础上构建蓝光诱导调控FNR表达系统。首先构建能表达FNR蛋白的A载体（pDh124-VP16-CRY2-USA-FNR）,蓝光诱导表达系统所需的B载体（pDb124-GAL4 BD-CIB1）为本实验室构建并保存。将A载体和B载体经两次珠磨法转化入amiR-FNR中,筛选并验证获得光控转化子amiR-FNR-B。检测藻株在白光诱导前后FNR的表达情况,qPCR结果显示,相比于红光培养,amiR-FNR-B在白光诱导2小时后FNR上调了47.2%,说明白光条件实现了FNR在amiR-FNR-B藻中的诱导表达,再将藻重新转移回红光条件下培养3小时后,FNR相比于白光诱导的结果下调了63.7%,提示ami R-FNR-B在红光条件下FNR停止诱导表达,并在内源amiRNA的作用下,FNR开始下调表达,而野生型和amiR-FNR无显著性变化,说明amiR-FNR-B具有光调控FNR表达的功能。通过在白光和红光条件下交替培养amiR-FNR-B,结果显示,白光培养3天至对数生长期时,检测到amiR-FNR-B的初始产氢量要比ami R-FNR低,经过“红光8 h—白光12 h—红光8 h”交替培养后,amiR-FNR-B的总产氢量比amiR-FNR提高了19%,比野生型CC-849提高了3倍,差异显著,提示光调控FNR表达促进了衣藻持续高效产氢。综上,该蓝光调控莱茵衣藻FNR表达系统在细胞内反应可逆、无毒害,操作简单方便,通过不同光质的间断诱导,实现了衣藻在白光下诱导表达FNR以回补光合同化效率,在红光下沉默FNR以进行产氢的循环运作,解决了衣藻细胞持续放氢的理论和技术瓶颈问题,为绿藻生物制氢技术及产业发展提供了新的技术途径。