研究背景:间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种拥有自我更新和多向分化能力的多能干细胞,来源于发育早期的中胚层和外胚层,在骨髓、脂肪、滑膜、脐带、肌肉等多种成体组织中都有存在,在特定的条件下可诱导分化为外胚层、中胚层、内胚层三个胚层的多种细胞,与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)相比,拥有取材方便、无免疫排斥反应、不存在伦理争议等优点,是组织工程和再生医学中一种较为理想的种子细胞。MSCs可以通过体外直接原代培养的方式获取,但在传代培养过程中,随着培养代数的增加,MSCs会伴随出现不可逆的复制性衰老。具体表现为原代培养的MSCs在传代8~10代后,细胞增殖能力逐渐减弱,生长变得非常缓慢,自我更新能力下降,失去向各系分化的能力。因而,通过原代培养而最终能够用于细胞治疗的MSCs数量非常有限。骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是最早被发现并研究的间充质干细胞之一。目前对于BMSCs的研究和报道都比较多,对于其用于临床方面的研究也是MSCs中最早的,因而有望成为最先应用于临床治疗的MSCs。BMSCs可通过全骨髓法和密度梯度离心等方法从骨髓中进行原代培养,取材较方便,并可通过对其特异性的表达CD29、CD44、CD105等标志物进行分离筛选。多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells,MAPCs)是一种从骨髓间充质干细胞中分离得到的一类多能干细胞,在形态上MAPCs与早期的ESCs相类似,部分细胞呈现克隆样生长,增殖能力和分化能力比MSCs更强,具有类似于ESCs的全能分化潜力,可连续传代80~120次而不出现衰老现象。目前有研究认为MAPCs是MSCs下的一个亚型,其培养条件与MSCs基本一致,并能共同表达CD105、SSEA-3等标志物。前期,我们通过ESCs-MAPCs-MSCs全基因组芯片,筛选到了一批差异基因。其中,我们挑选了在MSCs中高表达的mRNA prrx1做为研究对象,该基因编码的中胚层配对同源蛋白(paired mesoderm homeobox protein 1)是间充质的一个标志物,有研究表明prrx1可以直接参与细胞的上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),并且能够影响肿瘤细胞的增殖能力。脐带间充质干细胞(Umbilical mesenchymal stem cells,UMSCs)是从脐带中分离得到的间充质干细胞,与BMSCs相比,UMSCs拥有活力更好,增殖能力更强的优点。有研究证实在体外培养过程中,相同培养代数的UMSCs的倍增时间要明显短于BMSCs,UMSCs细胞周期G1期与S期的比例要远高于BMSCs。外泌体(exosomes)是细胞分泌的一种微小囊泡,直径大约在40~100nm之间。外泌体可以特异性的携带细胞所特异表达的活性物质,包括mirna,mrna,蛋白质等,通过胞吐与胞吞的方式与其他细胞通讯连接,传递所携带的活性物质。外泌体作为一种重要的旁分泌手段,可参与影响细胞的增殖、迁移、分化等过程。目前,已有间充质干细胞来源的外泌体促进其他细胞增殖的报道,提示mscs外泌体内可能含有调控mscs增殖的关键物质。目的:本课题的主要目的在于探索prrx1基因以及早代umscs外泌体在影响mscs增殖中的作用研究,寻找优化mscs的培养体系,籍此来解决mscs体外培养过程中带来的增殖减弱的困扰。第一部分:prrx1基因敲减在促mscs增殖中的作用研究方法:(1)通过escs-mapcs-mscs全基因组芯片筛选出在不同增殖能力的干细胞中差异表达的基因prrx1。(2)原代培养mscs,并通过免疫组化实验鉴定其成骨成软骨成脂肪诱导分化能力。(3)通过设计prrx1的sirna转染mscs的方式来构建prrx1表达降低的体系,并通过实时定量pcr验证干扰效率。(4)通过实时定量pcr和免疫荧光实验检测增殖相关标志物ki67的表达。(5)通过edu实验比较干扰prrx1后edu掺入水平的差异。(6)通过实时定量pcr比较干扰prrx1后多能性相关基因oct4、sox2、nanog的表达差异。(7)通过实时定量pcr比较干扰prrx1后上皮相关基因cdh1、epcam和间充质相关基因cdh2、vim的表达差异。结果:(1)通过原代培养的mscs可以成功分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞,符合mscs的特征。(2)干扰prrx1基因能够促进mscs增殖能力,提高增殖相关标志物ki67表达,并提高edu掺入比例。(3)干扰prrx1基因能够促进mscs自我更新能力,促进干细胞多能相关基因oct4、sox2、nanog的表达。(4)干扰prrx1基因能够促进上皮相关基因cdh1、epcam的表达,但不能降低间充质相关基因cdh2、vim的表达,且不能使细胞发生形态上的改变。结论:prrx1基因是mscs区别于mapcs、escs高表达的基因。干扰prrx1表达可以促进mscs的增殖能力,提高mscs的自我更新能力。但不能使mscs发生met转化。第二部分:umscs早代外泌体在促bmscs增殖中的作用研究方法:(1)原代培养umscs,用超速离心法收集早代umscs的外泌体(第二代和第三代)(2)通过纳米粒子分析系统和微流式成像系统对外泌体进行鉴定。(3)通过细胞周期实验、细胞生长曲线、edu实验检测加入p2和p3代外泌体后bmscs增殖能力的改变。结果:(1)纳米粒子分析系统和微流式成像系统证实超速离心法得到的外泌体在大小上和能够表达特异标志物方面符合外泌体的描述。(2)P2代外泌体可以促进BMSCs的增殖,增加细胞周期S期的比例,提高Edu的掺入率,增加细胞的数量。结论:超速离心法是一种简单有效的提取外泌体的方法。UMSCs早代的外泌体可以促进BMSCs的增殖能力,并且促进BMSCs增殖的活性物质可能存在于第二代UMSCs的外泌体中。第三部分:P2代外泌体中的促增殖成分鉴定与功能研究方法:(1)将收集的P2代及P3代外泌体进行SDS-PAGE电泳,通过银染结果选择差异亮度的条带送于蛋白质质谱检测,并对结果进行生物信息学分析。(2)将收集的P2代及P3代外泌体送于细胞因子蛋白质芯片,选取差异表达蛋白进行生物信息学分析。(3)对选取出的差异表达蛋白进行ELISA实验验证。(4)通过Edu实验检测在加入P2代UMSCs外泌体的同时加入CCR2抑制剂,对BMSCs Edu掺入水平的改变。结果:(1)质谱结果显示外泌体中绝大部分成分是角蛋白和微管蛋白。(2)细胞因子蛋白质芯片筛选出了P2代中高表达的增殖相关的蛋白CCR1和CCR2。(3)ELISA实验证实CCR1和CCR2在P2代外泌体中的含量较高,并且CCR2在P4和P5代外泌体中的表达比在P3代外泌体中的表达更少。(4)在P2代UMSCs外泌体中加入CCR2抑制剂后,P2代UMSCs外泌体的促增殖作用得到了削弱。结论:细胞因子蛋白质芯片是筛选促增殖功能相关蛋白的一种较为有效的办法。CCR2可能是P2代外泌体中促增殖的关键物质。