斑马鱼(Danio rerio)是一种在全世界广泛分布的热带观赏鱼,由于其具有如体型小巧、胚胎透明、发育迅速、性成熟时间短及基因组完成测序等优点,使得斑马鱼备受关注,成为世界公认的模式脊椎动物,应用于毒理学、病理学、发育生物学等多个研究领域中并取得了较为瞩目的成果。重金属具有高毒性、持久性、广泛性、难降解性等特征,经过自然途径及人类活动途径进入水体中将会造成水体污染并对鱼类的生存造成威胁,最终导致生态环境的破坏并影响人类的健康。而镉和铅则是水体重金属污染物中较为典型的污染物,具有一定的代表性。Keap1-Nrf2-ARE通路是一条重要的抗氧化应激相关的细胞通路,Nrf2(Nuclear factor erythroid 2/p45-related factor,Nrf2)是细胞调节的抗氧化应激反应的重要转录因子,先前本课题组的研究已经证实在铅处理下nrf2a、nrf2b表达均下调,表明Nrf2可能参与了金属铅中毒的应激反应。Keapl(Kelch-like ECH associated protein 1,Keap1)是体内Nrf2的重要负调控因子,在正常生理条件下,大多数的Nrf2与胞浆内的Keap1螯合在一起,使Nrf2无法进入细胞核内发挥其生物活性,从而使细胞内达到稳定状态;当在应激作用下,机体内产生大量活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS),Nrf2蛋白酶泛素化受阻,造成暂时性的Nrf2核移位,Nrf2进入细胞核与小Maf蛋白结合在位于细胞保护基因的上游启动子区域的抗氧化反应元件ARE(Anti-oxidant response element,ARE)上,从而启动下游一系列解毒和抗氧化因子(如Gstp1、Nqo1、Hsp70等)的基因表达。机体内的抗氧化系统,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)等的协同作用可以抑制ROS对细胞造成的伤害,最终增强细胞的防御能力。因此,本文选择了斑马鱼作为实验动物,探究不同类型重金属(镉和铅)以及不同浓度下处理斑马鱼胚胎后,对Keap1-Nrf2-ARE通路在基因水平以及蛋白质水平上造成的影响。由于前先课题组已经对Nrf2进行了一定程度的研究,所以本实验着重进行Keap1及Keap1-Nrf2-ARE通路的相关研究和探讨。通过NCBI搜索得知,斑马鱼有2个keap1同源基因,分别是keap1a和keap1b。本研究获得keap1a和keap1b的开放阅读框分别为1806和1782bp,分别编码601和593个氨基酸。为了研究不同物种间的Keap1蛋白差异,实验对Keap1蛋白进行了序列比对并构建了发育进化树进行分析,结果显示不同物种Keap1蛋白都含有BACK、BTB和多个ke1ch结构域且在物种间相对较保守。鱼类Keap1a先与其他脊椎动物聚为一支,再与鱼类Keap1b聚为一支,表明鱼类Keap1a 比 Keap1b更保守。实验选取斑马鱼发育的十个时期(1-cell、2-cell、3.5 hpf、6 hpf、12hpf、24 hpf、36hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf)进行原位杂交分析,结果显示keap1a和keap1b在各时期都有表达,极可能为母源表达基因。早期(24hpf之前)在全身广泛表达,24hpf后主要集中在头部表达。运用RT-PCR技术分析表明,keap1a和keap1b在斑马鱼成鱼不同组织中表达量不同,keap1a主要在眼、脑、心、肝、肌、皮肤中表达,而keap1b在各组织中均有表达。说明keap1a和keap1b虽为同源基因,但keap1b的表达相对更广泛。研究用不同浓度的镉和铅处理后,keap1a在48hpf之前对镉的应答更敏感,在48hpf之后对铅的应答更敏感。Keap1b在48hpf之后对镉的应答更敏感,而在48hpf时对铅无应答。表明keap1a和keap1b对重金属的应答反应已发生差异。为了证实重金属处理后机体内确实产生了氧化应激作用,实验对抗氧化相关指标SOD、MDA和GSH进行了测定,发现除SOD无明显变化以外,MDA和GSH测定值均有显著性变化,其中GSH在铅胁迫下上调尤为明显。同时运用荧光定量PCR技术和整体原位杂交技术分析了下游抗氧化相关基因表达量的变化,结果显示在镉和铅处理后,下游抗氧化相关基因表达总体呈现上调趋势,其中gstp1基因最为典型且具有浓度依赖性。因此推断重金属处理后确实使得细胞产生ROS,且上调了Keap 1-Nrf2-ARE通路相关基因的表达。最后纯化重组蛋白Keap 1 a、Keap 1 b、Nrf2a和Bach1b,试图在蛋白质水平上探究重金属在Keap1-Nrf2-ARE通路中的作用机制。本研究工作强化了基因表达分析在评估化学效应方面的实用性,有助于重金属的分子毒理学研究,更加有效快捷地评估重金属的早期环境风险。