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南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarcticlipase B,CALB)是一种优良的脂肪酶,在很多合成反应中都表现出特异性和很强的脂肪酶催化活性,比如水解、酯化、转酯反应等,因此广泛应用于手性化合物的拆分和有机物合成等领域。然而,CALB的表达量低和固定化工序复杂是导致CALB生产成本高的主要原因。目前多采用毕赤酵母表面展示手段,将CALB的表达和固定化集于一体以生产CALB。与毕赤酵母相比,大肠杆菌具有更短的发酵周期,因此利用大肠杆菌表面展示CALB更具有优势。Ag43(Antigen43,Ag43)是大肠杆菌Va型分泌系统分泌的单分子蛋白之一,自身包含了使其从细胞内分泌到细胞外所必须的信息,因此,Ag43可以自主转运分泌并展示于细胞表面。目前,通过外源蛋白与Ag43融合的手段已经将其发展成为了可以表面展示外源蛋白的Ag43自主转运系统。本课题以大肠杆菌Ag43自主转运系统为表达系统,通过基因工程方法将CALB与Ag43融合表达,使CALB表面展示于大肠杆菌细胞表面,并通过发酵优化提高CALB的产量,从而降低其制备成本。首先,本课题进行了能够表面展示CALB的Ag43表面展示系统的构建及表达分析。成功构建重组质粒 pTrc99a-Ag43’-WT-CALB、pTrc99a-Ag43’-NH-CALB、pbad99a-Ag43’-D551-CALB 和 pET28a-Ag43’-WT-CALB,将重组质粒转入了不同的大肠杆菌宿主菌株。对阳性重组菌诱导表达并进行SDS-PAGE分析,发现只有 pET28a-Ag43’-WT-CALB/BL21(DE3)可以成功表达融合蛋白Ag43’-WT-CALB。pET28a-Ag43’-WT-CALB/BL21(DE3)阳性重组子经诱导表达及胰蛋白酶处理全细胞后,进行SDS-PAGE分析,证明Ag43表面展示系统可以将CALB展示于BL21(DE3)细胞表面。接着,进行了 CALB的活性分析。CALB在三丁酸甘油酯平板产生水解圈,由此可知融合蛋白中的CALB具备活性。另外,针对全细胞催化剂pET28a-Ag43’-WT-CALB/BL21(DE3)进行了酶活体系优化,最适水解底物为pNPA,最适温度为45℃,最适pH为8.0。其次,本课题采用单因素实验对重组菌pET28a-Ag43’-WT-CALB/BL21(DE3)摇瓶发酵培养基成分及发酵条件进行了系统优化。确定最佳培养基成分为:甘油15.0 g/L,胰蛋白胨 32.0 g/L,酵母粉 16.0 g/L,(NH4)2SO4 2.5 g/L,MgS04 1.2 g/L,KH2PO4 2.3 g/L,K2HPO4·3H2O 16.4 g/L,混合微量元素 0.5 mL/L。其中混合微量元素母液(g/L):FeS04·7H20 2.8,MnCl2·4H20 2,CoS04·7H20 2.8,CaCl2·2H20 1.5,CuC12-2H2O0.2,ZnSO4·7H2O0.3,溶于1mol/LHCl 中。确定最佳发酵条件为:添加IPTG时机为7 h,诱导时间为4 h,IPTG添加终浓度为0.1 mM,最适诱导温度为30 ℃,培养基初始pH为7.6,接种量为1.00%(v/v),装液量为35 mL/250 mL。经发酵优化后,生物量由6.32提升至8.36(OD600吸光值),酶活由107.2U/mL提升至468.4U/mL。由此可知,优化后生物量及酶活均显著提高。