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目的:构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,优化表达条件,初步探讨表达蛋白的抑制血管活性。方法:从GenBank库中查找Arresten基因并获取其基因序列及蛋白序列,用DNAman软件设计引物。从健康产妇胎盘组织中提取人总RNA,经逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,低熔点琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化,纯化产物和质粒pBV220连接,并转化E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)感受态细胞,在氨苄阳性平板中筛选阳性菌落。重组质粒用PCR法和三种限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和PvuⅡ(基因序列155位的酶切位点)酶切进行鉴定,并进行序列测定,命名为pBV220-Arr。构建的重组质粒pBV220-Arr转化到宿主菌——E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中进行原核表达。经SDS-PAGE凝胶电泳图条带分析,并结合湿菌重筛选出最优表达菌种,进行培养温度、培养时间、表达温度、表达时间及溶解氧量五方面表达,确定最优表达体系;超声破菌,分离得到包涵体,并对其进行洗涤纯化复性,考马斯亮蓝法测定蛋白含量;鸡胚绒毛尿囊膜实验观察新生血管生长抑制情况。结果:成功筛选出Arresten基因,通过测序结果表明在第132、148、200、236位基因序列不同;通过成功构建的重组质粒pBV220-Arr,在E.coli JM109、DH5α、BL21、BL21(DE3)中均表达出Arresten蛋白,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为26KD,表达产物主要以包涵体形式存在;通过优化表达,结果在E.coli BL21(DE3)中30℃培养4 h,42℃诱导表达4 h,溶解氧量比例在1﹕5时表达量达到最高,表达量约占全菌蛋白的25%以上;进一步纯化表达,用2 mol/L尿素、2%的Triton X-100溶液和1M的蔗糖溶液,及少许的EDTA洗涤效果最好,表达量约占全菌蛋白的40%以上,用梯度稀释法复性得到Arresten蛋白;经活性分析证实初步复性的Arresten蛋白与阴性对照组比较统计学上有显著性差异,证明其有抑制新生血管生成的作用。结论:应用基因工程技术,成功筛选出Arresten基因,并构建了原核表达重组体pBV220-Arr;通过优化表达,得到最优表达菌种E.coli BL21(DE3)及最优表达条件,能高效表达重组Arresten蛋白;经过用尿素与Triton X-100及蔗糖溶液综合方法洗涤纯化,纯化效果最好并获得了较纯的Arresten蛋白;经过CAM试验证明,该蛋白具有良好的抑制新生血管生成的活性;Arresten蛋白具有良好的应用前景,通过对Arresten蛋白的研究,为进一步大规模高效表达和纯化Arresten目的蛋白提供了可靠的实验方法,也为肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。