多光子显微成像技术作为一种综合了毫米级成像深度以及亚细胞级别分辨率的成像工具,在活体动物及其组织的成像研究中得到了非常广泛的应用。不过传统的双光子显微成像技术由于信号背景比极限的缘故极大地限制了成像深度。科学家们通过自适应光学以及更换成像波长等策略一直未能在成像深度上取得较大进展。直到2013年康奈尔大学的Xu课题组开发出1700 nm窗口三光子成像技术突破了以往双光子成像在的深度限制。尽管此技术在脑成像中已得到了极为成功的应用,可是其能否在皮肤中实现同样可观的成像深度以及能得到何种程度的应用依然未知。因为皮肤组织与大脑组织十分不同:相比于皮肤,大脑的组织更加均匀,且透过率更高。而皮肤组织高度散射,分层复杂,仅表皮下20μm的范围内就有四种细胞层;再加上皮肤表面凹凸不平,还有毛孔的存在,这都会引入显著的像差。因此该技术是否适合深层皮肤成像仍然未知。针对此问题我们的工作主要集中在以下几点:1.开发简易、无损的小鼠皮肤视窗制作技术:由于以往固定小鼠皮肤视窗时主要采用将金属环缝制在小鼠皮肤上的策略,但这样一来势必会给小鼠皮肤带来损伤。因此我们将缝制的策略改为以牙科水泥作为粘合剂粘连的策略,在成功避免了对小鼠的损伤的同时也能够满足视窗稳定性的要求。2.活体小鼠皮肤波长对比:为了实现长短波长在皮肤多光子成像中的对比实验,我们设计了双色飞秒脉冲光源。利用一台中心波长为1550 nm的飞秒脉冲激光器作为泵浦光源分别激发棒状光子晶体光纤产生1700 nm波段的孤子,以及倍频晶体产生二次谐波。并利用这套系统证明了1700 nm波段优于800 nm波段的深层成像能力。3.测量与计算不同浸润介质的基本参数:利用“粗糙表面”的技术分别测出了三种多光子成像常用的浸润介质:硅油、矿物油、F30CC的从400 nm到1680 nm的折射率;随后使用软件Origin拟合出8参数的Sellmeier公式,并一次计算出以上三种浸润油的反常色散与三阶色散,为多光子皮肤成像浸润介质的选取提供了依据。4.标记活体小鼠皮肤中的弹力蛋白:采用眼眶注射sulforhodamine B的技术成功标记了小鼠中皮肤的弹力纤维,绕过了皮肤角质层这个染料难以渗入的天然屏障。随后结合了1700 nm波段三光子成像技术使成像深度穿透了整个小鼠的皮肤,克服了传统800 nm波段激发的深度限制。5.对皮肤中部分重要附属器的无标记成像:由于现今的诊断技术中比较缺乏针对皮肤中重要附属器的活检技术,我们试图从成像深度、图像清晰度及无标记以这几个重要指标入手来解决这个问题。我们利用1700 nm波段三光子成像技术提高成像深度与图像清晰度的问题;利用不同物质非线性极化率的不同产生三次谐波信号来替代染料标记。最终实现了对皮肤中髓鞘和汗管的高质量成像,为此项技术最终在人体中的使用打下了坚实的基础。