【摘 要】
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丙型肝炎是人类最常见的慢性传染性疾病之一,丙型肝炎病毒(HCV)是丙型肝炎的致病原。目前还没有有效地预防和根治此病的方法。HCVNS3是病毒基因组编码的非结构蛋白,具有多种
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丙型肝炎是人类最常见的慢性传染性疾病之一,丙型肝炎病毒(HCV)是丙型肝炎的致病原。目前还没有有效地预防和根治此病的方法。HCVNS3是病毒基因组编码的非结构蛋白,具有多种功能。其氨基端的NS3蛋白酶(1-180aa)是有效抑制病毒复制的重要靶点。本研究利用蛋白重组技术和噬菌体表面展示技术,设计表达和筛选具有抑制HCVNS3蛋白酶活性的抑制多肽,为特异性抗HCV的多肽药物研究奠定基础。 方法:(1) 用原核表达载体pQE-30分别构建含有NS3蛋白酶基因的pQE/NS3和含有单链NS3/4A基因的pQE/NS3/4A重组质粒;用重组质粒转化大肠杆菌M15,化学诱导表达目的蛋白并采用离子交换层析纯化蛋白。(2) 用酵母转化载体pPICZαA,构建含有NS3蛋白酶基因克隆的pPICZaA/NS3和含有单链NS3/4A克隆的pPICZαA/NS3/4A重组质粒;用重组质粒电转化酵母GS115,甲醇诱导表达并分级沉淀纯化NS3蛋白酶。(3) 利用高效原核表达载体pBVIL1和基因合成的方法,构建蛋白酶催化底物NS5A-B重组表达质粒pBVIL1/NS5A-B,转化大肠杆菌HB101,热诱导表达目的蛋白,采用离子交换层析的方法纯化蛋白;在体外用融合NS5A-B蛋白底物建立蛋白酶催化系统,并用SDS-PAGE、ELISA等方法对蛋白酶活性进行测定。(4) 根据蛋白酶底物特异性,设计合成底物竞争性抑制肽基因,并构建原核重组表达载体pBVIL1/H9,表达、纯化底物竞争性抑制肽;在体外用SDS-PAGE鉴定抑制活性。(5) 利用噬菌体表面展示技术,筛选具有抑制活性的NS3蛋白酶抑制肽,并在体外系统鉴定抑制活性。 结果:(1) 测序结果证实,构建的原核表达载体pQE/NS3和pQE/NS3/4A正确,
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