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本文从以下两方面进行论述: 第一部分 Hif-2α在乳腺癌细胞MCF-7中的表达 目的:观察不同氧条件下,乳腺癌细胞Hif-2α蛋白表达情况。 方法:取指数生长期的乳腺癌MCF-7细胞消化传代后分为12h、24h、48h、72h四个时间点分别放在常氧培养箱(37℃,21%02,5%C02,)和低氧培养箱(37℃1%02,5%C02,94%N2)培养后,提取蛋白,用Western blot法检测各个时间点蛋白的表达情况。 结果:Hif-2α蛋白在常氧、低氧下均有表达,且低氧下Hif-2α蛋白表达增高;Hif-2α的表达不呈时间依懒性,表达量在培养24小时达高峰,48小时、72小时缓慢下降。各个时间点,在不同氧条件下表达量差别均具有统计学意义(P<0.05)。 结论:Hif-2α能够在MCF-7细胞表达,且低氧能够促进Hif-2α的表达。 第二部分 RNA沉默Hif-2α蛋白表达后对乳腺癌细胞MCF-7生物学行为的影响 目的:验证Hif-2α基因表达是否被成功沉默;分析探讨Hif-2α对MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。 方法:应用RNAi技术沉默Hif-2α表达,用Lofectamine2000将前期已经构建好的带有shRNAHif-2α同源片段的质粒转入乳腺癌细胞MCF-7中。实验分为空白对照组(未转染组)、Control阴性对照组(转染空质粒组)、Hif-2αshRNA(转染Hif-2α质粒组)。用Western blot法检测Hif-2α蛋白抑制效果;用CCK8法、细胞划痕修复实验、Transwell侵袭实验测转染前后三组细胞的增殖、迁移、侵袭能力的变化。 结果:Western blot结果表明Hif-2αshRNA组hif-2α蛋白表达显著低于空白对照组、Control阴性对照组(P<0.01),说明hif-2α干扰基因成功转染入乳腺癌MCF-7细胞;CCK8法实验数据表明,三组MCF-7细胞培养至24、48小时增殖率没有差别(P>0.05),72小时后,Hif-2αshRNA组增殖率开始下降,与其他两组差别具有统计学意义(P<0.05),说明Hif-2α基因沉默能够抑制细胞的增殖;Transwell侵袭实验结果表明Hif-2αshRNA组侵袭能力均低于空白对照组、转染空质粒组(P<0.05);划痕修复实验数据表明,12小时细胞划痕迁移率三组细胞无明显差异(P>0.05),24小时划痕迁移率Hif-2αshRNA组明显低于其他两组(P<0.05)。 结论:Hif-2α被成功沉默;Hif-2α能够促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭、转移能力。