三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科人参属植物,为传统中医常用名贵药材之一,以其根及根茎入药,具有散瘀止血、消肿定痛等功效。三七总皂苷已被制成多种制剂用于临床治疗心脑血管疾病,其市场应用价值非常高。然而,经过几百年的栽培,三七对环境的适应能力逐渐下降,且连作障碍问题日益凸显。同时,由于三七的适宜生长环境较为局限,导致其药用资源不足。据报道,三七叶中同样富含三萜皂苷类成分。因此,三七叶的开发应用得到越来越多的关注。但三七叶能否替代其根、根茎入药仍然是一个疑问。尽管专家学者们已经做了大量的工作,由于缺乏系统性的研究,仍没有足够的证据支撑来准确回答上述问题。中草药的功效决定于其所含有的物质。那么,在回答三七叶能否替代三七根与根茎入药这个问题之前,需要首先解决两个主要问题,其一为三七叶中所含化学成分是否与三七根、根茎基本一致,其二为二者的药理作用是否基本一致。三七的传统药理作用为散瘀止血、消肿定痛,临床主要用于治疗心脑血管疾病,跌打损伤,瘀血肿痛等,这些疾病都与炎症密切相关。一氧化氮(Nitric oxide,NO)直接参与炎症反应的发生与发展。因此,调节NO产生可能是治疗炎症的重要途径。因此,本论文对三七叶的化学成分进行了系统研究,在此基础上,以能否抑制NO的产生为评价指标进行了抗炎活性成分的筛选,以期为三七叶能否替代三七根用药提供初步理论依据。采用大孔吸附树脂、正相硅胶、MCI gel CHP 20P、Sephadex LH-20和制备型高效液相色谱(PHPLC)等多种色谱技术及UV、IR、1H、13C NMR、1H 1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY、MS、旋光等波谱技术以及化学反应相结合的方法,对三七叶50%Et OH提取物的化学成分进行分离纯化和结构鉴定。从三七叶50%Et OH提取物中分离鉴定了60个单体成分。其中,24个为新化合物,均为达玛烷型三萜皂苷,命名为notoginsenosides NL-A1-NL-A4(1-4),NL-B1-NL-B3(5-7),NL-C1-NL-C3(8-10),NL-D(11),NL-E1-NL-E4(12-15),NL-F1(16),NL-F2(17),NL-G1(18),NL-G2(19),NL-H1-NL-H3(20-22),NL-I(23),NL-J(24);其中,notoginsenoside NL-J(24)为一新骨架化合物。同时,还得到了36个已知化合物,包括33个三萜皂苷,3β,12β,20S-trihydroxy-25-hydroperoxydammar-23-ene-3-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)-β-Dglucopyranosyl]-20-O-[β-D-xylopyranosyl(1→6)]-β-D-glucopyranoside(25),quinquenoside L3(26),floranotoginsenoside A(27),gypenoside LXIX(28),notoginsenoside Fh5(29),人参皂苷F2(30),三七皂苷Fe(31),七叶胆皂苷IX(32),gypenoside XVII(33),20(S)-protopanaxadiol-3-O-β-D-glucopyranoside-20-O-β-D-xylopyranosyl(1→4)-α-L-arabin opyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranoside(34),vina-ginsenoside-R18(35),ginsenoside Rd(36),人参皂苷Rc(37),人参皂苷Rb2(38),人参皂苷Rb3(39),人参皂苷Rb1(40),vina-ginsenoside-R7(41),notoginsenoside FP2(42),notoginsenoside FZ(43),notoginsenoside Fc(44),三七皂苷Fa(45),notoginsenoside S(46),notoginsenoside Fh1(47),notoginsenoside T(48),notoginsenoside D(49),3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-20-O-β-D-xylopyranosyl(1→6)-β-D-gl ucopyranosyl-darmmar-25-ene-3β,12β,20S,24S-tetraol(50),3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-25-烯-3β,12β,20S,24R-四醇(51),3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl-3β,12β,20S,24S-tetrahydroxydammar-25-ene-20-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside(52),notoginsenoside-Ng3(53),chikusetsusaponin L5(54),人参皂苷Rg1(55),三七皂苷R1(56),人参皂苷Re(57)以及3个黄酮类化合物,山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(58),槲皮素-3-O-β-D-吡喃木糖-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(59),槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(60)。其中,quinquenoside L3(26),vina-ginsenoside-R18(35),3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖基-20-O-β-D-吡喃木糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-25-烯-3β,12β,20S,24R-四醇(51)为首次从该种植物中获得,并首次报道了vina-ginsenoside-R18(35)的核磁共振波谱数据。以结构中6位是否有氧原子取代,将57个皂苷类成分分为原人参二醇(Protopanaxadiol,PPD)型(1-10,12-53)和原人参三醇(Protopanaxatriol,PPT)型(11、54-57)两大类。根据侧链组成的不同,将PPD型三萜皂苷的苷元分为8种。其中,以(20S,24ζ)-3β,12β,20,24,25-五羟基达玛烷和(20S,23R)-3β,20-二羟基-12β,23-环氧-达玛-24-烯为苷元的(20S)-PPD型皂苷仅见于三七叶中。此外,查阅文献发现,已知化合物中29、52和53尚未发现于三七的其他部位。以上特征性可用于区分三七叶和三七其他用药部位的提取物。同时,实验结果与文献相对照,提示三七叶与根中皂苷类成分确实存在明显差别,二者的主要皂苷类成分分别属于PPD和PPT型。成分的差异必将会导致药理活性的差异。因此,从化学成分的角度看,三七叶能否代替根、根茎作为临床用药,尚有待商榷。此外,通过比较(20S,24ζ)-3β,12β,20,24,25-五羟基达玛型皂苷以及(20S,24ζ)-3β,12β,20,24-四羟基-达玛-25-烯型皂苷中24位差向异构体的核磁数据(?δH22b-H22a、?δH23b-H23a:(20S,24ζ)-3β,12β,20,24,25-五羟基达玛型皂苷;ΔδH22b-H22a、δC-26:(20S,24ζ)-3β,12β,20,24-四羟基-达玛-25-烯型皂苷)及色谱保留行为(保留时间:24R>24S),总结了相应的规律,这一规律的总结为这两类皂苷及类似皂苷中C-24构型的快速确定提供了依据。在对三七叶化学成分分离鉴定的基础上,以RAW 264.7细胞为体外活性筛选模型,研究了新化合物1-24对LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO释放的抑制作用,并总结了构效关系。结果表明,C-22–24无产生绝对构型取代基团的三萜皂苷1、2、5、6、8–10在50μM浓度下,均能抑制RAW 264.7细胞释放NO,且在10、25、50μM浓度下,对NO产生的抑制作用呈现剂量依赖性;C-22–24有产生绝对构型取代基团的三萜皂苷13–18、21、23、24在25μM浓度下对NO的产生均具有抑制活性,该抑制活性在1、10、25μM浓度下呈剂量依赖性,特别是17和24,在1μM浓度下仍然具有较强的生物活性。总结三萜皂苷1、2、5、6、8–10的构效关系发现,皂苷中葡萄糖基的6位被木糖基取代活性强于被呋喃阿拉伯糖基取代(1 vs 2,8 vs 9);当取代糖基相同时,苷元类型不同会导致活性的不同,其活性强弱依次为:25-OH皂苷>25,26-烯-24-酮皂苷>25-OOH皂苷(5>8>1)。通过对比三萜皂苷12–18、21、23、24的活性差异发现,它们对NO产生的抑制作用随着取代糖基数目增多而增强(14>13>12;17>16);化合物15和17的活性比较结果提示,24,25-二羟基皂苷中24位羟基构型对活性具有很强的影响(24S>24R);化合物18、21和23的活性对比显示,当取代糖基相同时,苷元,(20S,23R)-3β,20-二羟基-12β,23-环氧-达玛-24-烯具有更强的抑制NO产生的活性(18,21 vs 23)。对比上述两类皂苷的活性发现,三七叶中C-22–24无产生绝对构型取代基团的三萜皂苷的活性强于C-22–24产生绝对构型取代基团的三萜皂苷的活性(5>12;6>14;9>14,给药浓度为25μM)。同时,查阅文献发现,三七叶主成分(部分已知化合物)同样对LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO的释放具有较强的抑制作用,进一步提示三七叶是一种潜在的可用于开发抗炎药物的中药材。综上所述,本课题采用多种波谱、色谱技术和化学反应相结合的方法,对三七叶的化学成分进行了系统性分离与结构鉴定,得到了系列新达玛烷型三萜皂苷,进一步完善了专家学者对三七叶化学组成方面的认知。在对所得三萜皂苷的结构特点进行归纳总结的过程中,发现了三七叶的特征性成分,可用于区分三七叶和三七的其他用药部位,进行药用部位提取物的真伪判断。此外,对比了三七叶与三七临床用药部位三七根的化学组成,进一步确认叶与根的主要皂苷成分分别为PPD和PPT型三萜皂苷,提示三七叶能否代替根、根茎作为临床用药,尚有待商榷。但值得指出的是PPD型皂苷相比PPT型皂苷在抗凝血、抗炎、抗肿瘤方面体现了优越性。同时,在化学分离的基础上,以LPS诱导的RAW 264.7细胞作为体外抗炎活性筛选模型,对所得的新化合物进行活性筛选,发现了具有潜在抗炎活性的三萜皂苷类成分;总结了测定化合物的构效关系,为结构修饰和改造提供了借鉴。但各活性成分发挥抗炎作用的机制尚有待于通过分子生物学或药理学实验进行明确。本课题研究为三七叶作为抗炎药物的研究与开发奠定了基础,为三七资源的再利用提供了借鉴。