论文部分内容阅读
目的：CD4为重要的淋巴细胞表面分子，属于免疫球蛋白家族膜锚定蛋白，与MHC-Ⅱ类分子结合，参与Th细胞TCR识别抗原的信号转导，产生相关免疫应答。草鱼是我国主要养殖鱼类，也是低等脊椎动物中硬骨鱼类的代表物种，对其免疫系统的研究有助于了解免疫系统的多样性以及脊椎动物免疫系统的进化，也可为水产养殖动物的病害防治提供理论依据。本研究旨在制备抗草鱼CD4L-2单克隆抗体，并分选出CD4L-2+细胞，为T细胞亚群分类及其功能研究奠定基础。 方法：基于转录组测序获得的草鱼CD4L-2基因信息设计特异引物，采用PCR技术分离草鱼肠道CD4L-2基因;应用qPCR方法分析草鱼CD4L-2基因的表达谱。原核表达抗原性较强的CD4L-2胞外段蛋白，以重组蛋白免疫小鼠获多抗;杂交瘤技术制备相应的mAb，并利用CIK细胞间接免疫荧光、Western blot、间接ELISA等方法检测其特异度与效价。采用Protein G亲和色谱法纯化抗草鱼CD4L-2的mAb，IAC技术纯化获得CIK细胞内靶蛋白，质谱分析靶蛋白与预测的草鱼CD4L-2蛋白的一致性。应用流式细胞术分选检测用PHA刺激草鱼前后的各免疫相关组织中CD4L-2+细胞比例变化特征;激光共聚焦鉴定草鱼肠粘膜中表达CD4L-2基因的细胞类型。 结果：草鱼CD4L-2基因的ORF长1290 bp，编码429个氨基酸，分为胞外区、跨膜区和胞质区三部分。胞外区含有3个Ig样结构域(V1-C1-C2)，胞质区包含保守的CXC基序。该CD4L-2分子胞外区存在多个保守性位点，如C1结构域中的WTC基序以及V1、C1和C2结构域中的N糖基化位点等。系统进化树分析显示，草鱼CD4L-2与斑马鱼、日本关东鲫、斑点叉尾鲴等鱼类的亲缘关系较近，草鱼CD4L-2基因表达于各种组织，表达量从高到低的顺序为血液、体肾、心脏、头肾、肠道、脾脏、鳃、胸腺、肝脏、鳍、肌肉、表皮等组织，也表达于肾细胞(CIK)中。获得的抗草鱼CD4L-2多抗与单抗的效价分别为1∶64000与1∶160000（杂交瘤细胞的保藏号为:CCTCC C2015189）。CIK细胞间接免疫荧光与Western blot分析结果显示，所制备的抗草鱼CD4L-2单克隆抗体能特异性识别自然状态下折叠的CD4L-2蛋白。质谱分析显示，靶蛋白与预测的草鱼CD4L-2蛋白的一致性可达66％。健康草鱼多数组织中含有CD4L-2+细胞，其在组织细胞中的百分比从高到低的顺序为胸腺、鳃、肝脏、肠道、脾脏、头肾、体肾、血液，其中，胸腺的CD4L-2+细胞含量极显著地高于血液与体肾(p＜0.01)，鳃、肝脏和肠道中CD4L-2+细胞含量显著高于血液与体肾(p＜0.05)。用PHA刺激48h后，各免疫相关组织中CD4L-2+细胞比例发生了明显变化，其中，头肾、脾脏、肝脏与肠道中CD4L-2+细胞比例显著升高，而胸腺中CD4L-2+细胞比例有所下降。激光共聚焦分析显示，肠粘膜中嗜酸性细胞、嗜中性细胞、单核细胞、淋巴细胞等均为CD4L-2+细胞。 结论：本研究克隆了草鱼CD4L-2基因，制备并鉴定了抗草鱼CD4L-2单克隆抗体，探明了草鱼CD4L-2+细胞在相关组织中的分布特征，初步明确了草鱼肠粘膜中表达CD4L-2+的细胞类型。鉴于CD4+T细胞在获得性免疫系统中的作用，抗草鱼CD4L-2单克隆抗体的获得，为鱼类T细胞亚群的分类及功能研究奠定了基础。