家禽β-防御素基因的克隆、原核表达及活性鉴定

来源 :河南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:pluto_jelly
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
防御素是动物和植物体内抗感染及激发特异性抗感染免疫的重要抗菌肽。Gallinacin-4(Gal-4)是禽类体内重要的β-防御素。本试验主要是对不同禽类β-防御素基因的克隆、原核表达及其生物活性的鉴定。1、参照Genbank已发表的NM001001610(Gallinacin-4)序列,由其成熟肽片断(CDS除去signal peptide和propiece)设计引物,从红羽丝毛乌骨鸡、固始鸭、固始鹅、鸵鸟、鸽的骨髓中提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增出大小约为117bp的基因片段,并把它克隆到pUCm-T Vector上,构建重组质粒pUCm-Gal-4,经PCR、酶切鉴定及DNA测序验证,该基因Gal-4为编码序列,比较表明:五个品种Gal-4基因序列及推导氨基酸序列均为117bp,编码38个氨基酸,同源性达到100%;与AY621319报告的Gal-4基因序列完全符合,与NM001001610序列有一个碱基不同。分别登录注册Genbank。登录号为:红羽丝毛乌鸡DQ673442、鸽子DQ860106、鸵鸟EF031035、固始鸭EF606702、固始鹅EF606703。Gal-4基因的克隆成功为进一步研究禽类的β—防御素基因功能和应用奠定了基础。2、分析Gal-4成熟肽基因序列117bp(含一个终止密码子),含有5个稀有密码子用原核常用的密码子替换,重新合成117bp基因,其氨基酸仍为原来氨基酸序列。在以上基础上,我们把新合成的基因片段分别引入BamHI、HindⅢ酶切位点,亚克隆到同样双酶切的大肠杆菌原核表达载体pGEX-4T-1(BamHI和HindⅢ)中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Gal-4,经PCR、酶切鉴定并进行确证性序列鉴定,结果表明,将Gal-4的基因正确地插入到原核表达载体pGLX-4T-1的目的位点,重组质粒pGEX-4T-1-Gal-4转化受体菌BL21(DE3)PlySs中,用IPTG诱导,经SDS-PAGE电泳显示,pGLX-4T-1-Gal-4表达产物分子质量约为30KDa,与理论推测的蛋白分子质量基本一致,进一步优化表达条件,1.0mmol/L IPTG在37℃诱导4小时条件下,表达量最大。3、重组蛋白的变性、复性研究。考虑到降解和表达产物对宿主菌的毒性作用的影响,用1.0mmol/L IPTG在37℃诱导4小时和25℃诱导2小时,其融合蛋白粗提物进行微量琼脂糖弥散法测定这种防御素的抗菌活性,对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(革兰氏阴性菌)和真菌(白色念珠菌)均无的抑制作用。其防御素的原核表达有待于进一步研究探讨。
其他文献
为改善传统k均值算法随机选择初始聚类中心导致算法稳定性较差这一问题,提出了一种基于样本空间分布密度的K-均值算法。改进算法将样本分布空间分割为多个大小相同的子空间,
如果小型设备的伺服电机联动控制采用PLC进行控制,会导致生产成本偏高。针对该问题,提出了利用单机片通过Modbus RTU通信完成对其控制的设计思路,有效地减小了成本支出,提高
针对大型液压支架立柱缸筒与缸底焊接变形进行了系统的分析,并详细论述了控制该类焊接变形的各种方式方法。
目的:建立制八角枫高效液相指纹图谱。方法:采用高效液相色谱法,色谱柱采用Alltech Apollo C18(4.6 mm×250 mm,5μm),以乙腈-缓冲液(缓冲液:0.2 g庚烷磺酸钠、3.5 g磷酸二氢
目的探讨特异性血管加压素v2受体(V2R)拮抗药托伐普坦对治疗失代偿期冠心病心力衰竭患者的价值和意史。方法将80例皿~Ⅳ级心功能的冠心痛患者随机均分为两组,即常规治疗组(对照组)
ue*M#’#dkB4##8#”专利申请号:00109“7公开号:1278062申请日:00.06.23公开日:00.12.27申请人地址:(100084川C京市海淀区清华园申请人:清华大学发明人:隋森芳文摘:本发明属于生物技
虚拟实验室是通过虚拟实验平台创建的一个虚拟仿真的学习环境,解决传统实验的难题,为高中生物实验教学开发一种新的教学模式和教学手段。虚拟实验具有吸引力强、效率高、精确
为探究溶蚀条件下纳米SiO 2混凝土微观特性和宏观性能的规律,采用2M NH 4 Cl溶液加速溶蚀试验,通过核磁共振技术、场发射扫描电镜和能谱分析研究孔隙特征、微观形貌及微结构
在新时代背景下,弘扬中华优秀传统文化,推进传统文化进校园已成为教育工作者的时代重任。本文以衡水科技工程学校为例,阐述了中职学校推进传统文化进校园的实施过程。
盾构法是一种在地下挖掘隧道的施工方法,在城市的地下铁路、电力通讯、上下水道和市政设施等得到了广泛的使用,尤其在地铁的隧道中使用的非常频繁。盾构法虽然有着诸多的优点