结肠癌是一种严重危害公众健康的常见恶性肿瘤。其病因尚未完全清楚,目前认为是环境因素与遗传因素综合作用的结果。其发病率以北美洲最高,约24-34/10万;在中国,东南沿海明显高于北方。近20多年来,世界大多数国家结肠癌发病率呈上升趋势;由于饮食结构的西化,中国结肠癌发病率的上升趋势也十分明显。而且,结肠癌的中位发病年龄在我国比欧美提前约十年,年轻人患病比欧美多见。结肠癌的起病隐匿,早期症状多不明显,易被忽视,从而影响了早期诊断。临床上,不少病人在明确诊断后已经失去了根治机会。由于早期诊断的困难,目前结肠癌的手术治疗以改善全身状态的姑息性手术为主;放疗的损伤和化疗的不敏感也限制了其疗效,而免疫治疗对结肠癌的疗效尚未明确。目前,寻找结肠癌新的特异性结合配体的尝试为其有效的诊断和治疗提供了希望。本研究利用人结肠癌细胞系HT-29,对两种噬菌体展示的随机多肽文库(fUSE5/6-mer和fUSE5/15-mer)进行了亲和筛选。之所以采取全细胞直接筛选的策略,是因为这种筛选方法与传统的纯化靶分子筛选相比,其作用方式更加接近天然的生物学状态,是一个不加选择压力的随机筛选过程,因此尤其适合于筛选诸如肿瘤细胞这样表面复杂度高、变异性强的细胞。为了筛选出与HT-29结合的高亲和力特异性噬菌体多肽,本研究将筛选条件进行了优化。在第一轮筛选中,选用了107以上的细胞数量和不严格的洗涤条件,以避免低含量的特异性克隆因强洗涤而丢失。待扩增之后,在后两轮的筛选过程中逐渐降低细胞数量,并增加洗涤次数,力争得到高亲和力的特异性噬菌体多肽。经过三轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,可以看出,从肿瘤细胞上洗脱下来的噬菌体滴度呈现出明显增加的趋势。在两种不同的多肽文库中,噬菌体滴度从第一轮到第三轮分别增加了208倍和1250倍,说明特异性的噬菌体多肽得到了富集。进一步细胞结合实验的鉴定结果也证明了这个结论。而且,经过反复的实验未检测到被细胞内吞的噬菌体多肽克隆。随后从三轮筛选的两个次级库中分别挑取了50个单克隆,细胞结合实验证实这些克隆均能不同程度地与HT-29结合。为了进一步说明这些单克隆是否具有与结肠癌细胞结合的肿瘤特异性,首先进行了细胞水平的鉴定。由于缺乏正常结肠的细胞系,因此利用同为消化道上皮起源的人肝脏正常上皮细胞L-02作为对照。本研究用了两种策略来验证多肽克隆在细胞水平的肿瘤特异性:一是直接鉴定,即直接通过细胞结合实验筛选出与HT-29结合而不与L-02结合的克隆;二是先负筛再鉴定,即首先利用L-02进行消减筛选,选取在筛选中不与L-02结合的次级库,再挑取单克隆,分别与HT-29和L-02做细胞结合实验。通过第一种方法,从与HT-29结合能力较强的克隆中直接鉴定出了某些6肽和15肽克隆不与L-02结合。利用负筛的方法,也得到了一些与HT-29结合而不与L-02结合的克隆。由于HT-29是