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[目的]NAFLD是全球慢性肝病常见原因之一。但是,目前NAFLD发病机制尚不清楚,临床上缺乏有效的治疗药物。SIRT2是机体内重要的去乙酰化酶,可通过催化不同底物去乙酰化参与多种生理病理调节过程。但SIRT2与NAFLD之间的关系鲜有报道。本部分旨在阐明SIRT2在NAFLD发生发展中的作用。[方法]首先,我们利用GEO数据库中NAFLD相关芯片数据,分析SIRT2在NAFLD患者肝脏组织标本及高脂饮食(high fat diet,HFD)诱导的NAFLD小鼠肝脏标本中的表达量。同时,我们构建了棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导的NAFLD细胞模型、HFD诱导的NAFLD动物模型及自发性脂肪肝基因鼠模型(ob/ob鼠),利用Western blot技术检测SIRT2在各种脂肪肝模型中的蛋白表达量变化。然后,我们在细胞模型中高/低表达SIRT2,观察SIRT2对肝细胞脂肪堆积的影响。并通过尾静脉注射高/低表达SIRT2腺相关病毒特异性干预小鼠体内肝脏中SIRT2的表达量,观察SIRT2对肝脏脂肪堆积、IR和炎症反应的影响。此外,我们构建了 SIRT2去乙酰化酶失活型质粒(SIRT2-H168A,SIRT2-H187Y)。在HepG2细胞中,转染SIRT2高表达及去乙酰化酶失活型质粒,观察SIRT2去乙酰化酶失活后对肝细胞脂肪堆积的影响。[结果]数据库分析结果提示,在HFD诱导的小鼠NAFLD模型中肝脏组织SIRT2表达量下调,同时,数据库结果显示在临床标本中肝脏组织SIRT2的表达量与NAFLD严重度有关。同时,我们在NAFLD动物及细胞模型实验也进一步验证了这一结果:SIRT2的表达随NAFLD的发展逐渐下降。进一步,我们通过体内体外高/低表达SIRT2,发现高表达SIRT2能够改善肝脏脂肪堆积、IR和炎症反应。而低表达SIRT2则加重了以上过程。最后,我们发现SIRT2去乙酰化酶失活后对肝细胞脂肪堆积的改善作用消失。[结论]在不同NAFLD模型中,肝脏中SIRT2的表达均下降。过表达/干预SIRT2后能够改善/加重肝脏脂肪堆积、IR和炎症反应。结果提示,SIRT2可能参与了 NAFLD的发病过程。并且,SIRT2对肝细胞脂肪堆积的改善作用与其去乙酰化酶活性有关。[目的]在第一部分研究中,我们利用多种NAFLD动物模型和体外诱导NAFLD细胞模型,综合应用生物信息技术以及体内体外过表达/干扰技术,发现SIRT2参与了NAFLD发病过程:过表达SIRT2能减轻小鼠肝脏及肝细胞的脂肪堆积,而干预SIRT2的表达能加重小鼠肝脏及肝细胞的脂肪堆积,但其改善NAFLD的具体分子机制尚不明确。本部分内容旨在阐述SIRT2调控NAFLD的具体分子机制。[方法]首先,我们通过生物信息分析技术,预测筛选出与SIRT2可能直接结合的蛋白(HNF4α)。继而,应用体外免疫共沉淀技术(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和免疫荧光技术(immunofluorescence,IF),验证细胞中SIRT2与HNF4α是否存在直接结合。然后,通过Western blot及RT-qPCR技术检测SIRT2对HNF4α及下游基因表达的影响;利用MG132及放线菌酮(cyclohexane,CHX)检测SIRT2对HNF4α蛋白的调控作用。进一步,我们在肝细胞内过表达/干预HNF4α的表达,观察其对SIRT2调控脂肪沉积作用的影响,明确SIRT2对脂肪沉积的作用是否依赖于HNF4α。由于SIRT2是体内重要的去乙酰化酶,我们进一步研究了 SIRT2是否能够影响HNF4α乙酰化水平。此外,我们在HepG2细胞中,通过转染SIRT2过表达质粒及SIRT2-siRNA,利用Co-IP及Western blot技术,检测HNF4a蛋白的乙酰化程度。构建HNF4α乙酰化突变质粒,在HepG2细胞中,共转染SIRT2-siRNA和HNF4α野生体(HNF4α-WT)及乙酰化突变质粒(HNF4a-K106R、HNF4a-K108R、HNF4a-K126R、HNF4a-K127R、HNF4a-K458R),通过Co-IP,检测SIRT2去乙酰化HNF4a蛋白的靶位点;最后,在HepG2细胞中,转染HNF4α-WT及目标位点乙酰化突变质粒,同时给与CHX处理,检测HNF4α蛋白乙酰化位点突变后对其蛋白稳定性的调控。[结果]生物信息分析、Co-IP、IF检测均发现SIRT2能够与HNF4α直接结合;在肝细胞中过表达SIRT2能够促进HNF4α蛋白和下游脂代谢基因的表达,而抑制SIRT2后能够抑制HNF4α蛋白表达和下游脂代谢基因的表达,而对HNF4α的mRNA水平无影响;MG132和CHX实验也进一步验证了 SIRT2从蛋白降解水平调控HNF4α。而且我们发现,在干预SIRT2表达的同时过表达HNF4α,或过表达SIRT2的同时干预HNF4α的表达,HNF4α可逆转SIRT2对肝细胞脂肪沉积的影响。此外,我们发现SIRT2过表达导致HNF4α乙酰化水平降低,而低表达SIRT2导致HNF4α乙酰化水平升高。而且,通共转染siRNA-SIRT2和HNF4α-WT及乙酰化突变质粒,我们发现HNF4α-K458位点乙酰化水平无明显变化,这一结果表明HNF4α-K458位点为SIRT2去乙酰化HNF4α的主要作用位点。同时我们发现K458位点乙酰化突变后,HNF4α蛋白稳定性增加。[结论]SIRT2通过直接结合HNF4α,去乙酰化HNF4α-K458位点,使得HNF4α蛋白稳定性增加,从而改善肝细胞脂肪沉积。