V-ATP酶是生物体内一种重要的酶,作为质子泵调节pH,从而维持生物体内的酸碱平衡。因其特殊的生物学功能,V-ATP酶在多种组织器官中发挥重要作用,在骨中尤为明显。V-ATP酶由多种亚基组成,其中已发现几种亚基在骨平衡的维持中十分必要,如B2、C1、a3、d2等。H亚基是近年来最新发现的一个小亚基,在V-ATP酶中起到重要的调节作用。但目前对该亚基的研究相对较少,其是否与其它亚基一样,也在骨中起到关键作用尚不清楚。骨的动态平衡由骨吸收和骨形成两个过程共同维系,任一过程异常都将打破平衡,导致骨相关疾病的产生。因此,本研究从成骨方面入手,旨在探究H亚基对成骨作用的影响及其分子机制,为进一步探明H亚基在骨平衡的维持及相关骨疾病发生过程中的作用打下良好的基础,并有望为相关疾病的治疗提供新的思路。研究内容如下:一、Atp6v1h基因敲除小鼠的制备、鉴定及饲养1、Atp6v1h基因敲除小鼠的制备:委托赛业转基因动物中心,利用CRISPR/Cas9技术制备Atp6v1h基因敲除小鼠。2、Atp6v1h基因敲除小鼠的鉴定:剪取出生第14 d左右小鼠鼠尾组织2-3 mm,经鼠尾裂解液处理后,提取鼠尾DNA并进行PCR,PCR产物委托华大基因公司进行测序,比对测序结果确定小鼠基因型。3、Atp6v1h基因敲除小鼠的饲养:所有小鼠均在第四军医大学动物中心SPF级饲养室进行饲养。二、Atp6v1h基因缺陷小鼠成骨特征的体内研究1、骨形态计量分析:取3 m龄雄性小鼠股骨制作石蜡切片,并分别进行H&E、改良丽春红和ALP染色,分析比较软骨和骨形成情况、骨量及骨小梁厚度变化情况以及骨表面ALP阳性成骨细胞数量和面积。2、骨骼生长的动态分析:取3 w龄雄性小鼠,分别在第1 d及第8 d注射钙黄绿素和二甲酚橙,第10 d处死,收集股骨制作硬组织切片,在激光共聚焦显微镜下观察拍照,计算矿化沉积率（MAR）、矿化表面积（MS/BS）、骨形成率（BFR）。3、生化代谢水平检测:取3 m龄雄性小鼠血清,用ELISA试剂盒检测其中碱性磷酸酶、骨钙素以及钙、磷的含量。4、野生型和Atp6v1h基因缺陷小鼠颅骨基因表达的差异研究:提取新生小鼠颅骨mRNA,反转录后进行实时定量PCR,检测成骨标志分子Col1a1、Alp、Bsp、Ocn、Opn等的表达量。三、ATP6V1H参与成骨细胞生物学特性调控的体外研究1、ATP6V1H对成骨细胞体外分化能力的影响:取3-5 d新生小鼠颅骨成骨细胞进行原代培养,对第3代细胞进行矿化诱导,分别在第7 d和第21 d进行碱性磷酸酶和茜素红染色,观察比较钙化结节的形成情况。2、ATP6V1H对成骨细胞相关功能基因表达的影响（1）野生型和Atp6v1h基因缺陷小鼠成骨细胞基因表达的差异研究:提取原代培养成骨细胞mRNA,反转录后进行实时定量PCR,检测成骨标志分子Col1a1、Alp、Bsp、Ocn、Opn等的表达量。（2）Atp6v1h基因沉默对原代培养成骨细胞相关功能基因表达的影响:用Atp6v1h siRNA转染野生型成骨细胞,提取转染后的成骨细胞mRNA,反转录后进行实时定量PCR,检测成骨标志分子Col1a1、Alp、Bsp、Ocn、Opn等的表达量。（3）Atp6v1h基因沉默对成骨细胞MC3T3-E1细胞系成骨相关功能基因表达的影响:用Atp6v1h siRNA转染成骨细胞MC3T3-E1细胞系,提取转染后的MC3T3-E1细胞mRNA,反转录后进行实时定量PCR,检测成骨标志分子Col1a1、Alp、Bsp、Ocn、Opn等的表达量。四、ATP6V1H参与成骨细胞和破骨细胞互动的机制研究1、Atp6v1h基因缺陷成骨细胞对破骨细胞形成的影响:将原代成骨细胞与单核细胞共同培养,在1α,25二羟维生素D3和前列腺素的刺激下,诱导产生多核破骨细胞,统计比较TRAP阳性多核破骨细胞的数量。2、Atp6v1h基因缺陷成骨细胞RANK和OPG信号分子的检测:提取原代培养成骨细胞蛋白,通过Western-blot测定RANKL、OPG的含量。分别收集原代培养成骨细胞的上清、3 m龄小鼠血清,通过ELISA测定其中RANKL、OPG的含量。3、Atp6v1h基因缺陷成骨细胞TGF-β1表达和活性的检测:提取原代培养成骨细胞蛋白,通过Western-blot测定TGF-β1的含量。分别收集原代培养成骨细胞的上清、3 m龄小鼠血清,通过ELISA测定其中TGF-β1的含量。实验结果如下:一、Atp6v1h基因敲除小鼠的制备、鉴定及饲养所有纯合型小鼠在胚胎第10 d时均已死亡,故本课题目前所有实验结果均是基于野生型与杂合型小鼠的比较。基因测序结果显示,与野生型小鼠基因序列相比对,Atp6v1h^+/-小鼠Atp6v1h基因中丢失一段5 bp（CGAGG）的序列,且一个T碱基被替换为G碱基。二、Atp6v1h基因缺陷小鼠成骨特征的体内研究1、骨形态计量分析:股骨组织H&E染色及改良丽春红染色结果显示Atp6v1h^+/-小鼠表现出软骨和骨形成的减少,ALP染色结果显示,Atp6v1h^+/-小鼠ALP染色强度降低,且分布不均匀,骨表面的ALP阳性成骨细胞的数量和面积均显著减少。2、骨骼生长的动态分析:结果显示Atp6v1h^+/-小鼠较野生型小鼠MAR和BFR均有所下降。3、生化代谢水平检测:Atp6v1h^+/-小鼠血清中碱性磷酸酶含量有升高,骨钙素含量没有明显改变,钙水平升高,磷水平降低。4、野生型和Atp6v1h基因缺陷小鼠颅骨基因表达的差异研究:Atp6v1h^+/-小鼠中各成骨标志分子表达量均未见明显改变。三、ATP6V1H参与成骨细胞生物学特性调控的体外研究1、ATP6V1H对成骨细胞体外分化能力的影响:碱性磷酸酶及茜素红染色显示野生型与杂合型成骨细胞均可形成钙化结节,其间无明显差别。2、ATP6V1H对成骨细胞相关功能基因表达的影响:（1）野生型和Atp6v1h基因缺陷成骨细胞基因表达的差异研究:Atp6v1h^+/-小鼠成骨细胞中,仅Col1a1、Alp、Bsp有所下降,其余分子均无明显改变。（2）Atp6v1h基因沉默对原代培养成骨细胞相关功能基因表达的影响:野生型原代培养成骨细胞的Atp6v1h沉默后,余成骨细胞标志分子均无明显改变。（3）Atp6v1h基因沉默对成骨细胞系MC3T3-E1细胞成骨相关功能基因表达的影响:MC3T3-E1细胞的Atp6v1h沉默后,仅Ocn、Opg有所改变,余无明显变化。四、ATP6V1H参与成骨细胞和破骨细胞互动的机制研究1、Atp6v1h基因缺陷成骨细胞对破骨细胞形成的影响:野生型成骨细胞诱导两种基因型单核细胞产生的TRAP阳性多核细胞数量无明显差别,而Atp6v1h^+/-成骨细胞诱导效果有差别,其诱导Atp6v1h^+/-单核细胞产生的TRAP阳性多核细胞数量更少。2、Atp6v1h基因缺陷成骨细胞RANKL和OPG信号分子的检测:Western-blot结果显示Atp6v1h^+/-成骨细胞中RANKL有所下降,而OPG无明显变化。ELISA结果显示,Atp6v1h^+/-血清中及诱导后的成骨细胞培养上清中RANKL均有所下降,而OPG均有所升高。3、Atp6v1h基因缺陷成骨细胞TGF-β1表达和活性的检测:Western-blot结果显示Atp6v1h^+/-成骨细胞中TGF-β1的表达无明显变化。ELISA结果显示,Atp6v1h^+/-小鼠血清中TGF-β1的表达下降,而诱导后的Atp6v1h^+/-成骨细胞培养上清中TGF-β1的表达有所升高。通过以上实验,我们发现Atp6v1h缺乏使小鼠体内骨形成过程受到抑制,这种抑制作用可以造成成骨细胞的少量基因变化,但不干扰其矿化功能。进而该种抑制作用干扰了成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用,并且可能是通过TGF-β1通路发挥这种作用的。