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人对氧磷酶1(Human Paraoxonase 1,hPON1)是人体血液中的一种非专一性酯酶,可以水解多种有机磷化合物,已有研究显示,PON1具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化和解救有机磷中毒等作用,且PON1比现有的有机磷解毒剂有更好的解毒作用。然而,纯化天然来源的PON1操作困难且效率较低;而利用大肠杆菌表达系统,外源蛋白表达量虽高,但多以包涵体的形式表达,需要复性,且蛋白质折叠往往存在问题。因此,为了得到较纯的具有活性的hPON1,本文采用巴斯德毕赤酵母表达系统,对hPON1进行胞内表达。首先,将hPON1基因经过密码子优化后克隆至pPICZA表达载体上,构建得到pPICZA-PON1重组表达质粒,经线性化后转化至巴斯德毕赤酵母X33菌株中,筛选得到阳性重组菌株。将重组菌株进行摇瓶发酵120 h,酶活力为0.15 U/mL。收集发酵液并细胞裂解后,用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,得到纯化的hPON1,SDS-PAGE结果显示表达产物的大小约37 kDa,与预期的蛋白分子量相符。其次,采用单因素试验与Box-Behnken组合设计方法进行有效结合的策略,通过对毕赤酵母中表达的发酵条件进行优化,提高rhPON1的表达量。最佳优化条件为:甲醇浓度1.42%,初始培养基pH值5.91,培养基装液量9.39%,预测rhPON1最大理论酶活力为0.737 U/mL。在最佳优化条件下得到的rhPON1酶活力0.735 U/mL,是在优化前条件下的酶活力的1.78倍。同时也考察了初始诱导菌体浓度对rhPON1表达量的影响,适当提高初始诱导菌体浓度能在诱导过程中促进rhPON1的表达,为进一步优化rhPON1在毕赤酵母中的表达提供依据。最后,通过对rhPON1进行酶学性质分析,得到rhPON1催化对pNPB和对氧磷两种不同底物的Km分别为:0.2727 mM和0.4860 mM,说明rhPON1与pNPB的亲和力更高。分别对两种底物的最适温度与pH进行探究,以pNPB为底物时,rhPON1的最适反应温度为45?C,最适反应pH为9.0,酶活力达0.57 U/m L;以对氧磷为底物时,rhPON1的最适反应温度为45?C,最适反应pH为8.5,酶活力达0.17 U/m L。综上所述,本研究成功表达并得到较纯的有活性的rhPON1蛋白,通过发酵条件优化,酶活力提高了78%。分析得到了rhPON1的最适pH、最适温度、金属离子对酶活性的影响、Km及Vmax等酶学性质,在此基础上,优化了酶催化的条件,使当底物为pPNB时,酶活力提高了280%;当底物为对氧磷时,酶活力提高了42%。