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大菱鲆(Scophthalmus maximus)是原产于大西洋东北部、欧洲沿海的一种冷水性鱼类。1992年由雷霁霖院士引进我国,目前已成为我国北方沿海重要的工厂化养殖鱼类。然而北方沿海夏季气温、水温都比较高,大菱鲆发病率、产卵量和死亡率较高,损害养殖效益,不利于大菱鲆工厂化养殖的进一步发展。本课题组从2007年开始对大菱鲆的耐温性状进行遗传改良,选育生长性能优良的耐高温新品系,目前已取得了可喜的进展,选育后代耐温性明显提高。为加快育种进程,挖掘与高温应答相关的功能基因,解析大菱鲆应答高温胁迫的分子机制,本研究通过分析高温胁迫条件下的皮肤组织转录组测序数据,筛选出数个与高温胁迫相关的抗逆基因,利用基因克隆、组织表达分析和原核表达等方法进行解析。以期在全基因组范围内了解大菱鲆应答高温胁迫的分子机制,为全面认识大菱鲆抗逆的分子机理奠定基础,并为大菱鲆耐高温遗传育种新标记的开发提供新的理论基础和研究方向。1.分析大菱鲆高温皮肤转录组数据库,对原始数据进行过滤,剔除了低质量数据后将clean reads进行混合拼接,得到217609条Unigene作为参考序列用于后续分析;采用Nr,Nt,Swiss-Prot,KEGG,GO,KOG和Pfam七大数据库对拼接的转录本进行功能注释,并对Unigene进行KEGG,GO和KOG功能分类;利用DESeq软件对实验组和对照组的差异基因筛选,得到3497个差异基因,其中包括2043个上调基因和1454个下调基因。通过标注的基因功能,进一步筛选出10个与高温胁迫相关的上调表达基因,设计简并引物,PCR扩增ORF序列,测序验证,得到6个序列正确的基因,分别为PDIA3、PDIA6、FTH1、HSP90β、SERPINH1、HSP70。2.利用RACE技术克隆上述6个基因,结果得到大菱鲆PDIA3、PDIA6完整基因序列。其中PDIA3 cDNA序列全长为2083bp,开放阅读框为1479bp,5′非编码区(UTR)和3′非编码区分别为85bp和519bp;该基因ORF区可编码一个由492个氨基酸残基组成的蛋白质,相对分子质量为54.92kD,理论等电点为5.40,包含一个由17个氨基酸组成的信号肽;目前该基因序列已经提交至NCBI,Genbank登录号为MG765516。PDIA6基因cDNA序列全长为2018bp,其中开放阅读框为1326bp,5′非编码区(UTR)和3′非编码区分别为95 bp和597bp;该基因ORF区可编码一个由441个氨基酸残基组成的蛋白质,相对分子质量为47.72kD,理论等电点为5.01,包含一个由19个氨基酸组成的信号肽;目前该基因序列已经提交至NCBI,Genbank登录号为MG787152。3.通过qPCR分析6个基因在大菱鲆肝脏、皮肤、鳃等8个组织中的相对表达量及14℃、20℃、25℃、28℃四个温度胁迫后各基因的差异表达变化,结果如下:PDIA3基因在肝脏中表达量最高(P<0.05),肠次之,在脑中表达量最低,随温度的升高,在肝脏和肠中的表达量随温度的升高相应上升,在28℃时达到最大(3倍、3.2倍);PDIA6基因在肝脏中表达量最高(P<0.05),心脏中最低,随着温度的升高,在肝脏和肾中的表达量也相应升高,都在28℃时达到最大值(2.8倍、2.5倍);FTH1基因在肝脏中表达量最高(P<0.05),脾和心脏次之,在鳃和肠中表达量最低,随着温度的升高,FTH1在肝脏和心脏中的表达量也相应升高,在28℃时达到最大值(2.8倍、4.1倍);HSP90β基因在心脏和脑中表达量最高(P<0.05),肝次之,在肾中表达量最低,在心脏和脾中的表达量随着温度的升高先升高后降低,在25℃达到最大值,分别为3.6倍和4.2倍;SERPINH1基因在肝脏中表达量最高(P<0.05),心脏次之,在鳃中表达量最低,在心脏和脾中的表达量随着温度的升高而显著升高,并在28℃时达到最大值,分别为5.3倍和7.2倍;HSP70基因在在脾中表达量最高(P<0.05),鳃次之,在皮肤中表达量最低,随着温度的升高,鳃和脾中HSP70的表达量先上升再下降,在25℃达到最大值,分别达到3.7倍和4.7倍。4.利用已克隆得到的完整PDIA3基因序列,设计带有酶切位点(BamH I、Hind III)的引物,PCR扩增其成熟肽编码片段,并与双酶切之后的pET-28a载体连接,成功构建了pET-28a-PDIA3表达载体;将pET-28a-PDIA3转入大肠杆菌DE3中诱导表达,诱导条件为37℃震荡培养到OD600nm约为0.6时,加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,继续震荡培养4h,通过SDS-PAGE电泳检测到目的蛋白的表达,但主要存在于包涵体中,不易于纯化;通过优化实验,改变不同的诱导条件,最后发现当温度为28℃、转速150rpm、IPTG浓度0.5mmol/L时,目的蛋白在上清中的表达量最大,有利于之后的蛋白纯化及功能验证。