双螺旋点扩展函数显微术能够实现荧光颗粒的大景深纳米分辨三维定位成像,并在超分辨荧光显微成像,三维单颗粒示踪等领域获得了广泛的应用,已成为研究生命科学问题的重要手段。然而,利用该技术对厚生物样品进行研究时仍然面临着诸多挑战,包括如何提高图像信噪比、时空分辨率和成像深度等。针对这些关键问题,在已有双螺旋点扩展函数显微技术基础上,发展了一种新的基于光片照明的双螺旋点扩展函数显微成像方法。该方法通过将光片照明技术和双螺旋点扩展函数的纳米定位方法相结合来实现对厚样品中单颗粒的三维纳米分辨成像和追踪。该方法具有图像对比度高、时空分辨率高,背景噪声低和成像深度深等优点。本论文的主要研究工作如下:(1)分析了现有三维单颗粒示踪技术的优缺点,进而提出基于光片照明的双螺旋点扩展函数显微成像方法,抑制背景荧光噪声,提高信噪比,实现三维纳米分辨单颗粒的成像和示踪。(2)阐述双螺旋点扩展函数超分辨显微术的基本理论与技术问题,基于MATLAB进行了数值模拟验证和设计了高效双螺旋相位片,建立了基于空间光调制器动态实现该相位片的方法。(3)提出一种基于鲍威尔棱镜和照明物镜相结合产生大视场、均匀强度分布光片的技术。基于此,设计和搭建了一套基于光片照明的双螺旋点扩展函数显微成像系统,并通过实验对系统进行优化和参量标定,实验结果与理论设计相一致。(4)利用该套显微系统开展了甘油溶液中单个荧光珠的三维成像和追踪实验,实验结果证明了系统的可靠性,为进一步对完整细胞等厚样品内的分子动态过程研究提供了理论和实验基础。