苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物,其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因,因此,深入发掘Bt新菌株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。近年来,鞘翅目害虫尤其是金龟甲科害虫的危害日趋严重,由于其幼虫生活在土壤中,给防治带来很大的困难,本研究从山东省土壤中分离Bt菌株,结合本室保存的菌株,利用PCR-RFLP鉴定体系对其进行基因型鉴定,在此基础上分离克隆对金龟甲科害虫有效的新型杀虫蛋白基因,研究该基因的表达和杀虫活性,为构建高效广谱的Bt工程菌和培育转基因抗虫植物提供新型基因资源。本研究的主要内容和结果如下:1本试验从山东省各地采集土样750份,采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相结合的方法从中分离出Bt菌57株,Bt菌株的平均分出率为7.60%,这些Bt菌株的晶体形态包括菱形、方形、圆形和不规则形等形状。2利用已设计的保守区通用引物S5un8/S3un8和S5un3/S3un3对本试验分离的和本室保存的菌株进行PCR扩增,对所鉴定的菌株中B-DLL和B-JJX菌株扩增出阳性片段,说明B-DLL和B-JJX菌株中含有cry8类基因,SDS-PAGE分析表明B-DLL和B-JJX菌株的杀虫晶体蛋白主要为130 kD。3杀虫活性测定结果表明菌株B-DLL在浓度为6.0×10~8 cfu/mL时对暗黑鳃金龟和琉璃弧丽金龟一龄幼虫14天的校正死亡率分别为26.67%、33.33%;对柳蓝叶甲96小时的校正死亡率为33.33%;菌株B-JJX在浓度为6.0×10~8 cfu/mL时对柳蓝叶甲96小时的校正死亡率为30.80%,对其它几种试虫没有活性。4以菌株B-DLL质粒为模板,对GenBank中公布的cry8类基因进行分析,设计了一对cry8类特异性引物JJX5和JJX3,PCR扩增出3.5 kb的目的片段,将其克隆到载体pBluescriptSK(+),经测序分析表明,该基因的编码框由3495个碱基组成,编码的蛋白质由1164个氨基酸残基组成。通过比较,该基因编码的氨基酸序列与Cry8Ea1的氨基酸序列同源性最高达99.31%,其中在第452、526、527、537、542、752、907和975位等8个氨基酸不同。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录(Accession number:EU047597),提交国际Bt-δ-内毒素命名委员会并被确认为一个新的杀虫蛋白基因,正式命名为cry8Ea2。5将cry8Ea2基因插入到大肠杆菌表达载体pET-21b(+)中,构建了T7启动子控制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b-cry8Ea,再将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够正常表达130 kD的蛋白。6 Cry8Ea2表达产物杀虫活性测定结果表明,该蛋白对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟和柳蓝叶甲等幼虫具有杀虫活性,在浓度为8.98μg/g土时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟一龄幼虫14天的校正死亡率分别为46.67%、55.56%;在浓度为89.8μg/mL时对柳蓝叶甲三龄幼虫96小时的校正死亡率为33.33%。而对华北大黑鳃金龟、茄二十八星瓢虫、黄粉虫、棉铃虫、甜菜夜蛾、粘虫、粉纹夜蛾等幼虫均未发现有活性。