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葡萄(Vitis)是世界性水果,也是我国重要经济果树之一。具有易成花,花芽早熟性和高节位分化特点。很多葡萄品种的一年生枝蔓从基部节位到顶端节位上的冬芽都可以进行花芽分化,并在翌年开花结果。尽管不同节位芽的发育时间长短存在明显差异,但其萌发以及花序抽生与开花的时间差异不大,这说明了葡萄枝蔓从基部到顶端不同节位花芽分化进程快慢不同,而最终出现"渐趋同步"的现象。目前,有关葡萄不同节位花芽分化进程快慢不同现象机理尚未见研究报道。为此,本研究以易高节位花芽分化的欧美杂交种’藤稔’葡萄为试材,通过对有关现象的进一步观察以及花发育相关基因表达的变化趋势的分析,初步揭示葡萄同一枝蔓上不同节位花芽发育进程快慢的规律以及"渐趋同步"的发育阶段,并对葡萄成花途径进行了验证,主要研究结果如下:1.为观察葡萄同一枝蔓上不同节位冬芽(混合芽)发育进程,通过短截和抹芽处理,对南京地区’藤捻’(’Fujiminori’)葡萄不同节位冬芽生长发育情况进行了观测与调查,对其发育的时期进行了归纳:处理与对照不同节位芽都能成花,同一枝蔓上基部第一个芽从4月下旬或5月初开始出现,顶部最后一个芽的形成时间是九月中旬左右。从同一枝蔓上不同节位芽发育的时间长短来看,基部第一个出现的芽生长发育所经历的时间比顶端最后一个出现的芽多5个月左右。虽然’藤稔’葡萄不同节位上的芽生长发育时间相差很大,但是翌年都能发育成花器官,且花期基本一致,存在不同节位花芽发育进程"渐趋同步"现象。2.根据Genbank上葡萄基因序列信息,设计与花发育相关VvAG、VvAP1、VvAP3、VvFT、VvFLC、VvSOC1以及VvFUL等7个基因特异引物。应用PCR技术从’藤稔’葡萄中获得各基因ORF区片段并进行克隆、转化,经PCR验证后测序。推导出这7个基因编码的氨基酸序列与已知的桃树等其他6个树种的同源基因进行系统发育分析,并构建系统进化树。分析结果表明,’藤稔’葡萄的7个与花发育相关基因与木本树种同源关系近于拟南芥,且分别与不同树种的同源基因表现出较高的相似性,在进化上具有一定的随机性。3.为了了解葡萄成花途径,以拟南芥成花途径相关基因序列为探针,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,获得相应的同源EST序列,并以葡萄不同发育时期的不同器官cDNA为模板,通过半定量RT-PCR反应研究了葡萄成花途径中相关基因的存在与表达情况,对葡萄成花途径进行归纳。研究发现,参与拟南芥成花途径的大部分基因也都存在于葡萄中。不同基因在不同器官、不同发育时期的时空表达存在强弱差异。4.为探究葡萄同一枝蔓上不同节位花芽发育进程"渐趋同步"的分子机理,以’藤稔’葡萄为试材,采用实时荧光定量PCR技术对不同节位8个与花发育相关基因在全年的时空表达研究发现:冬季休眠期芽仍具有较强的生理活动。不同基因在各节位花芽发育中表达水平存在一定差异:VvFT基因在休眠期前低水平表达,萌芽前后达到高峰;VvSOC1存在两个表达高峰,随节位升高两个表达高峰时间差在减少;与花器官发育相关的VvAP1、VvAP2、VvAP3、VvFUL和VvAG基因表达趋势不同。VvAP1和VvAP3存在两个明显的表达高峰,VvAP2、VvFUL、VvAG只存在一个表达高峰;VvFLC一直保持着较高的表达水平,随着芽的形成其表达量逐渐增再降低,表达高峰集中在9月-10月。不同节位上花芽的基因高水平表达持续时间也有所不同,上部的芽进入休眠前发育时间短,但休眠期处于活跃分化状态时间长。中低节位芽在休眠期也有相对中部芽较高或相近的基因表达水平。不同节位基因表达高峰期也存在先后差异,大多数花芽基因表达高峰期早的,其基因相对表达降低的速率也越快,这说明虽然下部和上部节位花芽的高峰期较晚,但在高峰期之后还能继续分化,分化效率高,最终不同节位的芽发育进程渐趋一致,花期相近。上述研究表明,休眠期是葡萄同一枝蔓上不同节位芽生长发育进程"渐趋同步"发生的关键时期。5.为更系统的揭示葡萄休眠期同一枝蔓不同部位芽发育"渐趋同步"发生的生物网络信息,对’藤稔’葡萄休眠期同一枝蔓的不同部位芽的RNA进行转录组测序和数据分析,转录组测序在底部、中部和顶部的花芽中分别得到28161327、28808716和27941132条Clean Reads;顶部、中部和底部芽的两两比较发现,顶部与基部芽之间的差异表达基因数(2639)>中部与底部芽(1564)>顶部与中部芽(398),且顶部芽中上调表达基因数>中部芽>底部芽。GO分析将差异表达基因归于23个生物学过程、11个细胞组分和11个分子功能,主要涉及细胞过程、代谢过程、刺激反应、生物调节、定位、定位建成、细胞、细胞组分、细胞器、细胞器部分和高分子化合物、连接、催化活性和结构分子活性。其中发现与葡萄花发育密切相关的基因101个,18个在顶部、中部和底部芽两两比较之间中存在差异,其中:高节位上调表达的基因有14个,能够从表达水平上解释不同节位芽发育进程"渐趋同步"现象。18个基因涉及光周期途径、春化途径以及赤霉素途径等葡萄成花调控途径。转录组测序资料也为进一步研究’藤稔’葡萄的成花提供了数据支撑。