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背景及目的:ETV6-RUNX1急性前体B淋巴细胞白血病（B cell precursor Acute lymphoblastic leukemia,BCP-ALL）是儿童和青少年中常见的恶性肿瘤。它的发生是一系列致癌性打击累积作用的结果。这些致癌性打击通常被划分为两步。第一步发生于子宫内,也即婴儿出生前,由t（12;21）（p13;q22）染色体易位形成ETV6-RUNX1融合基因,携带该融合基因的细胞为白血病前体细胞,具有向急性白血病转化的倾向。第二步发生于婴儿出生后,主要由RAG重组酶的活性异常造成。RAG重组酶的异常剪接导致出生后获得性遗传异常的产生,即二次或多次打击。获得性遗传异常的累积最终驱动了ETV6-RUNX1阳性前体B淋巴细胞向急性白血病的转化。前期研究发现,婴儿时期的感染免疫因素是造成RAG重组酶活性异常的原因。然而,首次打击ETV6-RUNX1和造成二次打击的RAG重组酶异常活化之间是否存在因果关系,目前尚无报道。因此,本研究的目的是探索ETV6-RUNX1急性淋巴细胞白血病的两次打击,即ETV6-RUNX1融合基因与RAG重组酶异常活化之间是否存在直接关系,如果存在,通过系统研究阐明其具体调控作用机制。以上问题的解决对揭示儿童急性淋巴细胞白血病的发病机制,进而指导白血病防治具有重要意义。研究方法:1.通过慢病毒转导和抗生素筛选,构建RUNX1或ETV6-RUNX1稳定表达细胞系Nalm6RUNX1和Nalm6ETV6-RUNX1,RT-q PCR和Western blot分别在m RNA水平和蛋白水平检测RUNX1或ETV6-RUNX1的表达是否与RAG1表达存在正相关性。构建RUNT DNA结合位点缺失突变的Nalm6truncated RUNX1细胞系,并检测RUNX1失活情况下RAG1转录表达的变化。2.收集BCP-ALL患者骨髓单个核细胞和前体B淋巴细胞（Nalm6和REH）,应用ETV6抗体和RUNX1抗体行染色质免疫沉淀基因测序（ChIP-Seq）检测,明确转录因子ETV6-RUNX1和RUNX1是否能够与RAG1基因转录调控区发生特异性结合,并读取特异性结合序列信息。3.通过慢病毒转导和抗生素筛选构建Nalm6RUNX1-Halotag、Nalm6RUNX1-HA、Nalm6RUNX1-HA+ETV6-RUNX1、Nalm6ETV6-RUNX1-Halotag、和Nalm6ETV6-RUNX1-Halotag+RUNX1稳定表达细胞系,采用标签抗体（Halotag或HA）行ChIP-q PCR,进一步验证转录因子ETV6-RUNX1和RUNX1与已鉴定的RAG1转录调控区的特异性结合作用,并比较这两个转录因子与RAG1转录调控区的结合是否存在竞争性。4.将已鉴定的RAG1-80bp启动子和-1200bp增强子序列克隆入荧光素酶报告质粒,分别检测ETV6-RUNX1或RUNX1高表达的条件下,荧光素酶的转录表达情况。应用Jaspar软件预测RUNX1与RAG1的潜在结合位点,筛选得到位点序列信息。分别构建-1200bp增强子和-80bp启动子与RUNX1特异结合位点缺失的荧光素酶报告质粒,检测特异性结合位点缺失后荧光素酶表达变化。5.构建CRISPR-d Cas9介导的转录活化系统,设计靶向RAG1-80bp启动子和-1200bp增强子的sg RNA,通过RT-q PCR和Western blot验证这两个顺式作用原件是否可在生理学水平调控RAG1的表达。6.采用RAG重组酶活性报告质粒GFPi,合成逆转录病毒构建Nalm6细胞RAG重组酶活性报告体系,流式细胞术定量检测RUNX1或ETV6-RUNX1表达的情况下,RAG重组酶活性的变化。研究结果:1.RUNX1和ETV6-RUNX1在m RNA水平和蛋白质水平均与RAG1转录表达呈正相关性,即当RUNX1或ETV6-RUNX1表达增高时,RAG1表达也增高。然而,当RUNX1基因的RUNT DNA结合结构域发生缺失突变时,失活的RUNX1不能再上调RAG1基因的表达。2.ChIP-Seq分析显示,在人BCP-ALL患者骨髓单个核细胞和前体B淋巴细胞系（Nalm6和REH）中,都观察到ETV6-RUNX1和RUNX1与RAG1上游转录调控区远端-1200bp序列和近端-80bp序列的特异性结合信号。近端-80bp序列组蛋白H3K4me3信号阳性提示其为活化的启动子。远端-1200bp区域可检测到H3K4me1信号,考虑为活化的增强子。3.ChIP-q PCR结果提示转录因子ETV6-RUNX1和RUNX1对RAG1的-1200bp增强子和-80bp启动子序列存在竞争性结合。ETV6-RUNX1优先结合-1200bp增强子,而RUNX1主要结合-80bp启动子。4.荧光素酶报告实验显示,RUNX1和ETV6-RUNX1可分别诱导-80bp启动子和-1200bp增强子序列引导的荧光素酶转录表达。当Jaspar软件筛选的RUNX1与RAG1潜在结合位点发生缺失突变时,转录因子对-80bp启动子和-1200bp增强子引导的转录表达功能消失。提示Jaspar筛选所得特异序列是RUNX1与RAG1结合的重要位点。5.CRISPR-d Cas9介导的转录活化研究显示,在前体B淋巴细胞生理条件下,靶向RAG1-80bp启动子的sg RNA能够显著上调RAG1的转录表达。靶向RAG1-1200bp增强子的sg RNA显著下调了RAG1蛋白的表达。证实RAG1的-80bp启动子和-1200bp增强子对RAG1的转录表达具有生理性调控作用。6.RAG重组酶活性报告实验显示,在前体B淋巴细胞中,ETV6-RUNX1和RUNX1都可直接诱导RAG重组酶活性升高。结论:综上,本研究揭示,在前体B淋巴细胞中,转录因子ETV6-RUNX1和RUNX1可与RAG1-1200bp远端增强子和-80bp近端启动子结合,直接上调RAG1的转录表达。同时,ETV6-RUNX1和RUNX1还可直接诱导RAG重组酶活性增高。异常活化表达的RAG重组酶诱导异常基因重排,从而产生新的基因突变,即二次打击或多次打击,最终推动ETV6-RUNX1前体B淋巴细胞克隆向急性淋巴细胞白血病的转化。