神经性疼痛是由神经系统原发性或继发性损害或功能障碍所引起的疼痛。背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)持续受压(chronic compression of DRG,CCD)导致大鼠出现受压侧的自发性疼痛、痛觉过敏和异常疼痛,同时伴随神经元的兴奋性增加,表现为自发性放电增加和电流阈值降低,与临床上腰椎间盘突出症等疾病所导致的症状相似。本课题组的前期研究表明,CCD手术后,大鼠出现手术同侧后肢的机械痛觉过敏和热痛觉过敏,但痛觉过敏的具体机制尚未明确。微管与微丝是细胞骨架的主要组成部分,参与维持细胞形态、保持细胞内部结构的有序性、转运细胞内物质等生理功能。微管是细胞骨架纤维中最粗的纤维,是由微管蛋白组成的直径约为25nm的中空圆柱状纤维。微管蛋白主要包括α-微管蛋白(a-tubulin, TUBA)、β-微管蛋白(p-tubulin, TUBB)和γ-微管蛋白(γ-tubulin,TUBG)。TUBA和TUBB以非共价键的形式连接形成异二聚体,异二聚体首尾相连则形成微管蛋白原纤维。哺乳动物中,13条微管蛋白原纤维构成1个中空的微管。紫杉醇是微管的稳定剂,稳定微管的聚合状态,抑制微管解聚。秋水仙碱是一种微管解聚剂,抑制微管聚合并促进微管解聚。微丝是细胞骨架结构中最细的纤维,直径7nm左右,主要由肌动蛋白螺旋状聚合形成,包含游离球状肌动蛋白(G-actin)和聚合纤维状肌动蛋白(F-actin)两种形式,只有后者具有生物学作用。细胞松弛素是微丝的解聚剂,可抑制微丝聚合并促进微丝解聚。鬼笔环肽是一种微丝稳定剂,具有稳定聚合微丝、抑制微丝解聚的作用。微管与微丝处于不断的解聚与聚合的动态平衡状态,这种动态平衡是完成生理功能的必要条件。研究证实,微管和微丝的解聚可降低炎性疼痛。炎性疼痛中,炎症细胞和炎症介质在趋化因子的作用下迁移到病变处发挥作用,其迁移是在微管的作用下完成的,低浓度(10-8mol/L)短时间(30-120分钟)应用微管解聚剂秋水仙碱可抑制炎性细胞的迁移,控制炎症。肾上腺素(epinephrine, EPI)及其下游产物可提高感觉神经元对疼痛的敏感性,而单独应用微管解聚剂或微丝解聚剂均可抑制肾上腺素诱导的痛觉过敏。微管也能够介导神经性疼痛。坐骨神经慢性压迫(sciatic chronic constriction injury, CCI)后,大鼠出现后肢的热痛觉过敏,注射秋水仙碱可缓解CCI所致的热痛觉过敏。因此,我们推测微管、微丝可能介导CCD大鼠机械痛觉过敏和热痛觉过敏,因此,本课题拟利用微管和微丝的解聚剂及聚合剂研究二者在CCD大鼠机械痛敏和热痛敏中的作用。持续受压后,大鼠的痛觉过敏和DRG神经元的高兴奋性与多种离子通道有关,如电压门控性Na+通道和K+通道、超极化激活性阳离子通道和瞬时感受器电位离子通道(transient receptor potential, TRP)通道等。瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4(transient receptor potential vanilloid subtype4, TRPV4)是TRP超家族成员之一,是一种Ca2+通透性较高的阳离子通道。DRG神经元的细胞膜、细胞浆和细胞核上均可检测到TRPV4,细胞膜上表达的TRPV4通道是介导痛觉过敏的主要部分。实验证据支持DRG中表达的TRPV4参与介导多种神经性疼痛和炎性疼痛。前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)可增强低渗或中度高渗溶液刺激引起的异常疼痛和痛觉过敏,TRPV4反义寡核苷酸干扰和基因敲除后,大鼠和小鼠的异常疼痛和痛觉过敏缓解。TRPV4反义寡核苷酸干扰后,微管稳定剂紫杉醇引起的机械痛觉过敏降低。本课题组的前期研究证实,TRPV4通道参与介导CCD大鼠的机械痛觉过敏和热痛觉过敏。微管、微丝与TRPV4直接相连并可调节TRPV4通道的功能。如微丝解聚后,TRPV4通道介导的内向电流和低渗休克导致的TRPV4通道的Ca2+内流受到抑制,TRPV4与肌动蛋白的共表达减少。结合TRPV4在CCD大鼠痛敏中的作用,我们推测,TRPV4可能参与微管、微丝对CCD大鼠痛敏的调节过程。因此,本课题中,我们拟观察微管、微丝对CCD大鼠痛敏的影响,并研究微管、微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能、表达和定位的影响,为微管、微丝对CCD大鼠痛敏的调节提供可能的作用机制。目的1.研究微管解聚剂秋水仙碱对CCD大鼠机械痛觉过敏和热痛觉过敏的影响。2.研究秋水仙碱对TRPV4通道功能和表达的影响,探讨微管解聚影响CCD大鼠痛觉过敏的机制。材料与方法1.CCD模型的制备应用戊巴比妥钠(50mg/kg)行腹腔注射麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,暴露横突的根部及L4-L5椎间外孔后,将每侧长4mm,直径0.63mm的“L”形不锈钢棒沿L4-L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。通过控制“L”形棒椎管壁外侧端使其椎管内端沿椎骨内壁缓慢下滑至椎管中部,恒定地压迫DRG及邻近神经根。术后用生理盐水冲洗切口,依次缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,腹腔注射青霉素40万单位预防感染,术后密切观察大鼠生命体征变化。2.神经行为学的测定对CCD大鼠的手术侧及正常大鼠的同侧后肢进行行为学检测,时间为：术前,术后第4、6、7、14、28天；药物对行为学影响检测时间为：药物处理前测量,排除痛觉表现不明显者(<5%)；药物处理后0.5、1、2、4、8小时分别测量。大鼠的机械痛觉过敏采用机械缩足反射阈值(Mechanical withdrawal threshold, MWT)测量,使用BME-403型、Von Frey Fibers机械痛刺激仪进行。将不同强度的Von Frey纤维由低到高依次地刺激CCD大鼠手术侧或正常大鼠同侧后肢足底中部并维持5秒,阳性反应为出现快速缩足或舔足现象。每个强度的纤维刺激5次,机械缩足反射阈值为至少能够引发3次缩足反应的纤维强度。大鼠热痛觉过敏通过热辐射刺激缩爪反应潜伏期(paw withdrawal latency,PWL)来确定,采用BME-410C型热痛刺激仪测量。大鼠安静后,将光源焦距对准CCD大鼠手术侧或正常大鼠同侧后肢足底中心。从开始照射到引起后肢回缩反应所需的时间,即为当次热辐射刺激缩爪反应潜伏期。每肢照射5次,测量结果的均值即为此大鼠的热辐射刺激缩爪反应潜伏期。3.成年大鼠DRG神经元的培养取出CCD术后第7天手术侧L4-L5的DRG和正常大鼠同侧L4-L5的DRG,Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶分别消化1小时和30分钟后,应用Neurobasal+1%N2+20ng/mlNGF+1%谷氨酰胺+100U/ml青链霉素培养,培养第4天的DRG神经元用于全细胞膜片钳技术、细胞活性测定及免疫细胞化学检测等后续实验。4.HEK293细胞的培养和转染HEK293细胞培养于10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中,3-4天传代一次,传代后24小时转染。Lipofectamine2000脂质体和(?)TRPV4-GFP质粒先各自加入一定量的缓冲液OPTI-MEM中,混匀后静置5分钟。将两者再混匀,室温放置20-30分钟。将质粒脂质体混合物加入HEK293细胞培养液中孵育4-6小时,然后将培养液更换为包含血清和抗生素的DMEM培养液。转染后24-48小时进行电生理实验或细胞活性检测。5.细胞活性检测将成年大鼠DRG神经元和HEK293-TRPV4细胞以1×104／孔的密度接种于96孔培养板,在不同浓度秋水仙碱培养基中培养2小时后,吸去原培养液,每孔加入80μl培养液和20μl5mg/ml的四甲基偶氮唑(3-[4,5-dimethylthiazol-2-y1]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)。经37℃孵箱孵育4小时后,将上清液吸去后应用PBS冲洗后,每孔加入150μl甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)溶剂。将孔板放置在摇床上,通过10分钟的低速震荡即可充分溶解结晶。应用酶标检测仪测定波长490nm处的吸光度OD值,各组均以正正常培养基培养的成年大鼠DRG神经元的吸光度作为100%,其他情况下的吸光度数值需与之相比较。6.全细胞膜片钳记录TRPV4通道的电流采用常规高阻抗封接的全细胞记录方式,检测DRG神经元及HEK293-TRPV4细胞中TRPV4通道介导的内向电流。电极内液(mmol/L):140CsCl,2NaCl,3MgCl2,10Hepes,5EGTA (290mOsm),用CsOH调节pH至7.25,用针头式滤器(孔径0.22μm)过滤后分装,-20℃保存。电极入水电阻为3-6MΩ。电极外液(mmol/L):124NaCl,5KC1,1.2KH2PO4,1.3MgCl2,2.4CaCl2,26NaHCO3(310mOsm),用NaOH调节pH至7.35,4℃保存。7.实时定量RT-PCR检测CCD术后第7天,鞘内注射不同浓度秋水仙碱0.5-8小时后,从各组大鼠手术侧L4-L5DRG中提取RNA,实时定量RT-PCR检测TRPV4mRNA表达的变化。8. Western blotting检测CCD术后第7天,鞘内注射不同浓度秋水仙碱0.5-8小时后,从各组大鼠手术侧L4-L5DRG中提取蛋白质,Western blotting检测TRPV4蛋白表达的变化。9.组织免疫荧光及免疫细胞化学检测TRPV4的定位将DRG组织切片及培养的DRG神经元用冷丙酮固定10分钟后(-20℃),加入2%BSA室温封闭1小时,然后加入TRPV4一抗4℃孵育过夜。PBS冲洗3次后,加入带有绿色荧光标记的TRPV4二抗室温孵育1小时。使用DAPI细胞核染色后,封片,荧光显微镜下观察TRPV4在DRG神经元的定位区域。结果1.鞘内注射微管解聚剂秋水仙碱可缓解CCD大鼠的痛觉过敏CCD术后,大鼠手术侧机械和热痛觉阈值降低(P＜0.05)。术后7天时,手术侧机械痛觉阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期降至最低(P＜0.01),此后逐渐升高。625μg/kg-1250μg/kg的秋水仙碱可部分抑制CCD后大鼠的机械痛敏和热痛敏,此抑制作用(P＜0.05)呈剂量依赖性升高。此抑制作用于鞘注秋水仙碱后30分钟可测得,2小时作用达到最大,此抑制作用可持续至8小时,而312.5μg/kg秋水仙碱则无抑制作用(P＞0.05)。2.微管解聚剂秋水仙碱对DRG神经元以及HEK293-TRPV4细胞活性的影响0.1μg/ml秋水仙碱对DRG神经元和HEK293-TRPV4细胞的活性无影响。其中,0.1μg/ml秋水仙碱分别孵育DRG神经元和HEK293-TRPV4细胞0.5小时和2小时,细胞活性均未受影响(P＞0.05)3.微管解聚剂秋水仙碱对正常大鼠DRG神经元TRPV4通道功能的影响秋水仙碱孵育后,正常大鼠DRG神经元TRPV4的电流降低。秋水仙碱0.01μ/ml,0.05μg/ml和O.1μg/ml孵育DRG神经元2小时后,TRPV4的内向电流分别为201.62±4.72pA、165.25±7.44pA和128.41±±3.75pA。因此,秋水仙碱对DRG神经元TRPV4电流的抑制呈剂量依赖性,且0.1μg/ml秋水仙碱对TRPV4电流的影响最大(P<0.05)。因此,在本课题中,将0.1μg/ml秋水仙碱作为最适浓度。4.微管解聚剂秋水仙碱对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能的影响与正常大鼠DRG神经元TRPV4电流相比,CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道介导的内向电流峰值增加(CCD大鼠电流峰值为310.19±9.17pA,正常大鼠为230.55±17.23pA,P<0.05)。CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道的电流峰值延迟(CCD大鼠为243.6s,正常大鼠为172.4s,P＜0.05)。0.1μg/ml秋水仙碱孵育2小时后,CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道电流峰值降低,且峰值时间延迟(230.10±12.10pA,199.1s,P＜0.05)5.微管解聚剂秋水仙碱对HEK293-TRPV4细胞TRPV4通道功能的影响0.1μg/ml秋水仙碱孵育2小时后,HEK293-TRPV4细胞的TRPV4通道电流峰值降低,且峰值时间延迟(正常HEK293-TRPV4细胞为412.50±27.15pA,131.6s;秋水仙碱组为219.53±5.24pA和42.7s,P＜0.05)。孵育秋水仙碱后,HEK293-TRPV4细胞的内向电流表现出典型的TRPV4通道的外向整流特性,但逆转电位更倾向于正相电位。6.微管解聚剂秋水仙碱对TRPV4通道表达的影响鞘内注射625μg/kg-1250μg/kg秋水仙碱时,TRPV4通道的基因表达明显降低,其中,鞘内注射1250μg/kg秋水仙碱2小时,TRPV4通道的基因表达下降最明显(P＜0.05)。当鞘内注射625μg/kg-1250μg/kg秋水仙碱时,TRPV4通道的蛋白表达显著降低,其中,鞘内注射1250μg/kg秋水仙碱2小时和4小时,TRPV4通道的蛋白表达下降最明显(P＜0.05)7.微管解聚剂秋水仙碱对TRPV4定位的影响组织免疫荧光的结果提示,鞘内注射1250μg/kg秋水仙碱未影响CCD大鼠背根神经节TRPV4的定位。DRG神经元的免疫细胞化学结果示,DRG神经元上胞膜表达的TRPV4多于胞浆内表达的TRPV4,并且秋水仙碱并未影响TRPV4的定位。结论1.微管解聚剂秋水仙碱缓解CCD大鼠的机械痛敏和热痛敏。2.秋水仙碱可抑带(?)TRPV4的表达,降低TRPV4通道的电流峰值,因此,TRPV4介导了秋水仙碱对CCD大鼠痛敏的缓解作用。目的1.研究微丝在CCD大鼠痛觉过敏中的作用。2.研究微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能和定位的影响,探讨微丝调控CCD大鼠痛觉过敏的机制。方法1.CCD模型的制备大鼠被随机分为CCD组和假手术组。戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,暴露右侧L4-L5椎间外孔后,将每侧长4mm,外径0.63mm的中空的“L”形不锈钢棒沿L4-L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,恒定地压迫DRG及其邻近的神经根。不锈钢棒外套有内径0.51mm,30-40mm长的硅胶管,硅胶管的外端置于椎管壁外,内端随中空钢棒一起插入椎管内,硅胶管内充满肝素。硅胶管的外端是封闭的,只有注射药物时打开。术后用生理盐水冲洗切口,依次用4-0丝线缝合肌肉、筋膜和皮肤,并注射青霉素40万单位以预防感染。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。术后大鼠没有发生伤侧肢体自噬现象。2.神经行为学的测定分别于手术后7天注射化学药物前及注射药物后1、2、4、6、8、24小时测量,排除痛觉表现不明显者(<5%)；所有的测量在一个安静的环境内进行,室温保持在26±0.5℃,且均使用单盲法。药物通过与压迫DRG的中空不锈钢管相连的硅胶管直接注射。大鼠机械缩足反射阈值和热辐射刺激缩爪反应潜伏期的测量方法同第一部分。3.成年大鼠DRG神经元的培养CCD术后7天,取出手术侧L4-L5的DRG。细胞培养方法同第一部分。4.细胞活性检测成年大鼠DRG神经元在细胞松弛素B或鬼笔环肽培养基中培养2小时后,用于检测DRG神经元的活性,检测方法同第一部分。5.全细胞膜片钳记录TRPV4通道的电流同第一部分。6.免疫细胞化学同第一部分。结果1.微丝对CCD大鼠痛觉过敏的影响所有实验大鼠在手术前后及给药处理前后步态均正正常,足无畸形,评分均为1分,损伤前、后各组间无显著性差异。微丝解聚剂细胞松弛素B和细胞松弛素D皆可缓解CCD大鼠的机械痛敏和热痛敏(n=9,P＜0.01)。细胞松弛素B(200μg-300μg)可部分抑制CCD大鼠的痛敏,且此抑制作用呈剂量依赖性表现,然而,100μg细胞松弛素B无此抑制作用(P＞0.05,n=9)。CCD大鼠痛敏的缓解在注射细胞松弛素B后1小时出现,2小时达到高峰,持续少于24小时。微丝聚合剂鬼笔环肽单独注射对CCD大鼠的机械和热痛敏的影响无统计学意义(P＞0.05,n=9)。细胞松弛素B注射前1小时注射鬼笔环肽可以抑制细胞松弛素B对CCD大鼠痛敏的缓解作用(n=9)。2.微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4通道功能的影响CCD组TRPV4的电流峰值远高于假手术组(CCD组n=12,假手术组n=10,P＜0.05)。细胞松弛素B和细胞松弛素D均可显著抑制(?)TRPV4的电流峰值(CCD组为310.19±9.17pA,细胞松弛素B组为245.48±12.12pA,细胞松弛素D组为237.81±10.17pA,各组中n=12,P＜0.05)。这与二者对CCD大鼠痛敏的影响一致。经微丝解聚剂孵育后,DRG神经元的I/V曲线表现出典型的TRPV4外向整流的特性,然而,逆转电位更倾向于正相电位,这与微丝对TRPV4(?)降值电流的抑制相一致。CCD大鼠DRG神经元的峰值时间延迟(CCD组为243.60±20.00s,假手术组为200.37±15.40s,P＜0.05)。经微丝解聚剂孵育后,CCD大鼠DRG神经元TRPV4电流峰值时间提前(细胞松弛素B组为123.44±10.10s,细胞松弛素D组为193.76±12.40s,P＜0.05)。微丝稳定剂鬼笔环肽(10-SM)可导致TRPV4电流的峰值降低和延迟(80.87±5.42pA,311.72±14.56s,n=12,P＜0.01),这与鬼笔环肽对CCD大鼠痛敏的影响不一致。与鬼笔环肽对TRPV4电流影响一致的是,DRG神经元I/V曲线更倾向于正相电位。MTT实验结果表明,微丝的解聚剂和稳定剂对于DRG神经元的活性无影响(P＞0.05)。3.微丝对CCD大鼠DRG神经元TRPV4定位的影响CCD大鼠DRG神经元细胞膜上表达的TRPV4多于细胞浆中表达的TRPV4。经细胞松弛素B(10-4M)孵育2小时后,DRG神经元细胞膜上TRPV4的表达量明显降低(CCD组为83.62±2.14%,细胞松弛素B组为69.63±3.41%,P＜0.05)。此外,鬼笔环肽(10-SM)也导致DRG神经元细胞膜上TRPV4的表达量降低(54.24±2.44%,P＜0.05)结论1.微丝解聚缓解CCD大鼠的痛觉过敏,微丝稳定剂可消除微丝解聚剂的镇痛作用。2.微丝解聚抑伟TRPV4通道的电流峰值,降低神经元细胞膜上TRPV4的表达,因此,微丝通过TRPV4通道调节CCD大鼠的痛觉过敏。