【研究背景】食管癌(esophageal carcinoma,EC)是食管上皮组织的恶性肿瘤,发病年龄多在40岁以上,男女比约为2~4:1。食管癌全球每年发病约50万例,在所有恶性肿瘤中占2%;年死亡约40万例,居全球癌症死亡例数的第6位。国内食管癌发病率占全球50%以上,患者5年生存率不到10%。在食管癌发生的高危区,鳞状细胞癌是主要的组织学类型,在癌症死因中居第七位。食管鳞癌患者病死率高,预后不良,手术风险较大,并且缺乏特异性的诊断及预后评估指标。食管鳞癌的发病机制目前仍不十分清楚。1999年由Yntema等发现的核糖体S6激酶4(p90 ribosomal protein S6 kinase 4,RSK4)是核糖体S6蛋白激酶(RSK)基因家族成员之一,其定位于人类Xq21位点,具有X染色体连锁基因的特性,处于Ras-MAPKs信号传导途径的下游,是MAPK/ERK激酶途径中最重要的下游调控因子及Ras通路中重要的信号传递分子。RSK4作为一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与细胞周期调控,影响细胞的增殖、分化及凋亡。据文献报道,RSK4在结肠癌、肾细胞癌、乳腺癌、子宫内膜癌等肿瘤中存在异常表达,提示其与肿瘤的发生、发展相关联。然而,目前对于RSK4与食管癌的相关研究尚未见报道。p63于1998年由Yang等首次发现,其与p53和p73的基因序列及功能具有很高的同源性。有研究表明,p63在细胞生物学上与肿瘤的发生有关,在浸润性肿瘤中,由于基底层细胞或肌上皮细胞的缺失,p63表达往往缺失。大量实验证据表明,p63在外胚层分化发展和复层上皮祖细胞的维护中扮演重要角色,其与p53的抑癌功能相反,许多鳞癌组织细胞伴有p63的过表达,提示p63可能是一个潜在的致癌基因。最新研究发现,p63基因敲除小鼠的皮肤鳞状上皮细胞RSK4表达下调,提示在鳞状上皮中两者可能有一定相关性。另外,本课题组前期发现,RSK4在肾细胞癌及胰腺癌中表达高于相应的正常组织,提示其可能具有癌基因的功能。然而,目前RSK4与p63在食管鳞癌中的表达情况及其与食管鳞癌的进展关系尚不清楚,这正是本课题着眼的研究内容。【目的】本研究运用组织病理学及分子生物学方法,明确RSK4及p63的表达与食管鳞癌患者临床病理特征和预后的关系,并初步探讨其作为潜在的食管鳞癌恶性进展的分子标志及预后评估因子的可能,研究RSK4与p63及其相互关系,将有助于探讨食管鳞癌的发生发展机制,为其临床早期诊断、治疗以及预后评估提供一定的理论依据。【方法】1.利用免疫组织化学Envision两步法,对72例食管鳞癌组织中RSK4及p63的蛋白表达及两者相关性进行研究。2.q RT-PCR:从食管鳞癌细胞系及正常食管细胞中提取m RNA,进一步反转录为c DNA,采用q RT-PCR检测其RSK4及p63 m RNA的表达水平。3.Western blot:从食管鳞癌细胞系及正常食管细胞中提取蛋白,定量后进行SDS-PAGE电泳,转膜后孵育一抗及二抗,最后通过ECL化学发光检测RSK4和p63的蛋白表达情况。4.统计学处理:应用SPSS19.0软件中的卡方检验、Kaplan-Meier法及Cox风险回归模型分别进行相关性分析和生存分析,研究食管鳞癌组织中RSK4及p63的表达与患者临床病理特征的相关性,并探索其与预后的关系。【结果】1.食管鳞癌与癌旁组织中RSK4和p63的表达与分布免疫组织化学染色结果发现RSK4及p63在食管鳞癌组织中的表达高于肿瘤周围组织。2.RSK4与p63在食管鳞癌组织中的表达及相关性分析72例食管鳞癌组织中RSK4阳性表达率为62.5%(45/72),而p63阳性表达率为83.3%(60/72)。RSK4和p63均为阳性的有42例,均为阴性的有9例,经Pearson相关分析,RSK4与p63的表达呈正相关。3.RSK4与p63在食管鳞癌细胞系中的表达水平检测RSK4及p63 m RNA水平和蛋白水平在食管鳞癌细胞系中的表达较正常食管细胞高,并且不同食管鳞癌细胞系之间的RSK4及p63的表达水平各不相同。4.食管鳞癌组织RSK4的表达与临床病理特征的关系72例食管鳞癌组织中,RSK4表达阳性共有45例(45/72,62.5%)。分析RSK4表达与其中66例手术患者临床病理特征的关系,结果显示:p T1~p T2期阳性率为48.3%(14/29),p T3~p T4期阳性率为73.0%(27/37),随着临床病理分期的增高,RSK4阳性率明显升高,且两者RSK4表达差异具有统计学意义,即RSK4阳性表达与肿瘤的p T分期具有显著相关性。另外,RSK4的表达与分化程度以及淋巴转移有关。然而,RSK4的表达水平与患者其他几项临床病理特征(性别、年龄、肿瘤大小、大体分型等)无统计学意义。5.食管鳞癌组织中p63的表达与临床病理特征的关系72例食管鳞癌组织中,p63表达阳性共有60例(60/72,83.8%)。分析p63表达与其中66例手术患者临床病理特征的关系,结果显示:p T1~p T2期阳性率为75.9%(22/29),而p T3~p T4期阳性率为89.2%(33/37),且两者p63的表达差异无统计学意义。此外,p63的表达水平与患者其他几项临床病理特征(性别、年龄、肿瘤大小、大体分型、有无淋巴转移等)也无相关关系。6.RSK4及p63与食管鳞癌患者生存预后的关系单因素生存及多因素生存分析结果显示,RSK4阳性表达与食管鳞癌患者不良预后具有相关性,且分期、分化程度、有无淋巴结转移等因素均可影响食管鳞癌患者的生存期,而吸烟、大体分型与其预后不存在相关关系。统计结果发现,p63阳性表达及各项临床病理特征均与食管鳞癌的预后无关。【结论】本研究发现RSK4及p63在食管鳞癌组织及细胞系中的表达明显上调,并且RSK4与食管鳞癌患者的p T分期、分化程度、淋巴结转移、生存预后之间存在显著相关,而p63与上述指标无相关性,提示RSK4可能作为潜在的食管鳞癌恶性进展的分子标志及预后评估因子,为进一步探索RSK4与p63的相互关系及其在食管鳞癌发生发展的分子机制奠定研究基础。