一、研究背景和目的异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是目前治疗各种造血系统及非造血系统肿瘤、再生障碍性贫血、自身免疫性疾病及某些遗传性疾病的主要和有效手段。allo-HSCT的效果、预后、移植后患者的无病生存率、长期生存率及生活质量取决于患者移植后免疫系统的重建情况、移植物抗宿主病（GVHD）的发生和程度、移植物抗肿瘤（GVT）效应及继发感染等。其中,GVHD发生情况和患者移植后免疫系统重建情况,包括免疫缺陷的程度、持续时间及是否发生继发性感染等,是影响allo-HSCT效果及预后的关键。移植后GVHD及免疫重建延迟或GVT效应削弱等导致的感染、肿瘤复发以及第二肿瘤发生是allo-HSCT后的主要并发症和致死原因,严重影响忠者移植后长期生存率和生活质量。因此,降低移植后GVHD发生率、减轻GVHD严重程度、提高GVT效应、减少免疫缺陷持续时间、减轻免疫缺陷程度及加速免疫系统重建是提高患者移植后长期生存率和生存质量的重要方法和手段。间充质干细胞（MSCs）是一种具有多分化潜能的非造血干细胞,广泛分布于骨髓、脐血、脂肪等组织中。MSCs表面低表达MHC-Ⅰ,不表达MHC-Ⅱ和共刺激分子CD40、CD40L、B7-1、B7-2,同时能逃避同种异基因T淋巴细胞的识别,提示MSCs具有弱免疫原性,能抑制T、B、NK、DC细胞的功能,通过各种途径释放细胞因子或通过细胞间直接或（和）间接作用,诱导免疫耐受。MSCs因具有多器官归巢、优先定位于受损伤靶器官、参与细胞分化及免疫调节等特点,已被广泛应用于allo-HSCT后GVHD的预防与治疗、器官移植后排斥反应的预防以及组织工程及各种自身免疫性疾病的治疗等方面。照射、化疗、免疫抑制剂等因素被认为能够促进MSCs的归巢以及向组织特异性细胞的分化,但具体机制尚不清楚。目前有关受体免疫功能是否影响MSCs在体内植入的研究较少。本实验以同基因小鼠及裸鼠模型为基础,经尾静脉输注MSCs,应用实时定量PCR法定期追踪体内Y染色体标记MSCs,分别观察供体细胞在各受鼠体内的分布与定居情况,有助于我们了解MSCs是否在正常与免疫缺陷受体中的分布、定居及迁移方面存在差异,为MSCs移植安全性的评价提供前期实验的研究基础。现时预防及治疗GVHD的措施主要是大量应用细胞毒药物及免疫抑制剂,虽然可有效降低GVHD的发生,但同时也削弱GVT效应,加重移植后患者的免疫缺陷程度,使移植后感染及肿瘤复发率明显提高。如何建立特异性免疫耐受减轻GVHD同时保留GVT效应,是改善allo-HSCT效果亟待解决的问题,也是移植免疫学所面临的难题。近年来,越来越多的研究表明MSCs在造血支持及免疫调节方面发挥着重要作用,提示MSCs可能在减轻GVHD反应同时增强GVT效应中扮演重要的角色,是应用前景最为广阔的种子细胞。本研究另外构建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤动物模型,将第三方KM小鼠骨髓MSCs经体外培养后与近交系C₅₇BL/6小鼠的脾脏及骨髓细胞共移植,探讨第三方来源MSCs在促进MHC不相合allo-HSCT后免疫重建、诱导免疫耐受的同时对GVT效应的影响。二、研究方法1、构建同基因小鼠及裸鼠模型2、实验分组:分别于输注MSCs后24h、72h、1w、2w及1w、2w、4w、6w分批处死雌性BALB/c同基因小鼠及裸鼠（5只/批）,并依次留取肺脏、肝脏、脾脏、结肠、胸腺及骨髓组织。3、实时定量PCR（SYBR Green法）检测各组受鼠器官组织SRY基因相对表达水平4、构建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤动物模型5、实验分组:实验分7组,分别为低剂量第三方MSCs移植组（A组）,中剂量第三方MSCs移植组（B组）,高剂量第三方MSCs移植组（C组）,高剂量供鼠MSCs移植对照组（D组）,单纯allo-HSCT组（E组）,B16+TBI对照组（F组）,B16成瘤对照组（G组）。6、造血重建标准:外周血白细胞计数（WBC）＞1.0×10⁹/L为造血重建指标,并通过嵌合体检测证实骨髓植入成功。7、嵌合体检测:PCR扩增外周血基因组Y染色体基因8、aGVHD表现与评分标准:aGVHD判断通过观察:体重变化、食欲、精神状态,活动能力,皮肤黏膜,腹泻等情况,并计算平均生存时间;另取濒死受鼠皮肤、肝脏、小肠等组织进行病理学检查。9、流式细胞仪（FACS）检测外周血T淋巴细胞亚群:于骨髓移植后+7d开始,每周每组取3～4只受鼠行FACS检测外周血CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺及CD4⁺CD25⁺比例变化。10、外周血上清细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及TGF-β检测:移植后+14d采用ELISA方法进行检测。11、移植动物成瘤情况观察:肿瘤导致死亡判断标准:动物死亡时WBC＞1.5×10⁹/L,肿瘤明显增大,甚至破溃坏死,无明显aGVHD临床表现。待出现可触及的肿块时记为肿瘤出现时间,用游标千分尺测量肿瘤的最长直径（L）和与其垂直的最大横径（W）,以后每3d测量1次,直至肿瘤出现破溃或小鼠死亡。12、统计学分析:实验数据采用SPSS 13.0统计软件包进行处理。结果用均数±标准差（（?）±SD）表示,采用析因方差分析分别对不同时间段的同基因小鼠及裸鼠的肺脏、肝脏、脾脏、结肠、胸腺、外周血及骨髓等脏器组织的SRY基因表达变化差异进行统计分析,多组间比较采用One-way ANOVA进行统计分析,移植后外周血淋巴细胞亚群变化采用重复测量统计分析,组间比较采用LSD或Dunnett’s T3多重比较法。一个因变量与多个自变量间的线性数量关系用linearregression进行逐步回归统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。并对小鼠生存时间进行Kaplan-Meier生存模型分析,绘制生存时间曲线。缺失数据:预处理后存活时间少于5d视为移植失败,不作统计。三、研究结果1、各同基因小鼠及裸鼠输注MSCs后均存活,未发现有毒副作用。2、各组受鼠脏器组织在不同时间段SRY mRNA表达水平均存在明显交互效应。同基因组小鼠输注MSCs 24h后SRY基因在各脏器中表达具有显著差异,在外周血及骨髓中均可检测到有较强表达,72h后外周血表达水平开始显著下降,至1w后几乎无表达;肺脏、肠道、肝脏及骨髓中SRY基因随时间推延表达显著增强,除肺脏表达水平于1w后开始下降外,其余组织均直至2w后表达才逐渐下降;而脾脏在各时期内均未检测到有SRY基因表达;裸鼠各脏器除外周血外在实验观察期内均能检测出SRY基因表达,且表达水平与同基因组小鼠同期相比明显增强。肺脏与肠道表达水平均推迟至4w后才开始下降,6w后检测仍可见有少量SRY基因表达;脾脏在输注早期高表达SRY基因,2w后表达稍有下降,然后随时间推延呈逐渐增强趋势;肝脏、胸腺及骨髓表达水平持续增加。3、先将小鼠B16细胞株接种于BALB/c受鼠右前腋下（1.0×10⁷/ml,0.1ml/只）,采用全身照射为移植前预处理,总剂量8.0Gy,剂量率0.5Gy/min。移植组小鼠每只共输注5.0×10⁶个骨髓单个核细胞和1.0×10⁷个脾细胞。各移植组小鼠均得到造血重建,各移植组小鼠aGVHD发生率为100%。4、造血重建:各移植组小鼠于+3d时WBC计数降至最低,此后逐步恢复,A～E组小鼠WBC≥1.0×10⁹/L时间分别为:（9.50±0.58）d,（8.25±0.50）d,（7.05±0.50）d,（7.00±0.82）d,（10.75±0.96）d。共输注MSCs组较单纯allo-HSCT明显缩短造血重建时间（P＜0.05）,其中A组与B组、B组与C组比较均具有显著差异,表明造血重建时间随MSCs输注量增多而逐渐缩短;而相同数量的第三方及供者来源MSCs组问比较无统计学意义（P=0.641）。5、嵌合体检测:+14d各移植组外周血PCR产物中均能检测到供鼠Y染色体,提示供鼠骨髓细胞在受体内植入成功。6、aGVHD表现:各移植组小鼠的体重随着GVHD的出现均呈下降趋势。单纯allo-HSCT组小鼠最早于移植+6d至+8d出现少食少动、消瘦、弓背、腹泻、毛发紊乱无光泽、精神倦怠等aGVHD表现。共输注高剂量第三方及供者来源MSCs组小鼠出现aGVHD时间为移植+10d至+12d,较单纯allo-HSCT组小鼠出现aGVHD时间明显延迟,且这两组小鼠仅有轻度脱毛,精神状态良好。共输注低剂量第三方MSCs组小鼠出现aGVHD时间约为+9d至+10d,症状与单纯allo-HSCT组小鼠无明显差异。共输注中剂量第三方MSCs组小鼠在移植+9d至+11d期间出现aGVHD,表现较allo-HSCT组轻微,但仍有较明显aGVHD症状。各移植组小鼠aGVHD发生率为100%。aGVHD评分显示:A组aGVHD评分指数为1.50±0.55分,B组aGVHD评分指数为1.33±0.52分,C组aGVHD评分指数为0.67±0.52分,D组aGVHD评分指数为0.50±0.55分,E组aGVHD评分指数为1.83±0.41分。提示第三方或供者来源MSCs均可有效降低GVHD发生率及严重程度。7、aGVHD组织病理检查:各移植组GVHD发生时的病理改变基本一致,共输注低剂量MSCs及单纯allo-HSCT组病变较严重,其余共输注MSCs各组病变较轻。8、各移植组小鼠生存时间:A～G组分别为:（21.88±6.88）d,（24.38±5.83）d,（31.63±9.35）d,（32.25±8.62）d,（14.50±1.78）d,（15.13±1.81）d,（17.50±1.85）d。MSCs共移植组存活时间较单纯allo-HSCT明显延长（P＜0.01）,提示MSCs能有效延长受鼠生存时间;而输注第三方及供者来源MSCs组间比较无明显差异（P=0.860）,最终各移植组均死于aGVHD。9、外周血T淋巴细胞亚群:在移植+14d内A组及E组CD4⁺/CD8⁺比例持续倒置,而MSCs共移植C、D组比值均高于正常。各检测时间段MSCs共移植组CD4⁺/CD8⁺比例均高于单纯allo-HSCT组,尤其以C、D组显著。在移植+21d各组比例达到峰值,A～D组分别为1.25±0.18,2.16±0.19,3.23±0.53,3.52±1.29;MSCs共移植组CD4⁺CD25⁺细胞比例在各检测时间段均高于单纯allo-HSCT组,在移植+21d各组比例达到峰值,A～D组分别为1.62±0.33,3.18±0.69,3.72±0.57,3.67±1.11。随移植进程各组CD4⁺/CD8⁺比值及CD4⁺CD25⁺细胞比例逐渐下降,LSD多重比较分析得出:除C、D组间比较无统计学意义外,其余各MSCs共移植组均存在显著性差异（P＜0.02）,提示MSCs能提高外周血中CD4⁺/CD8⁺比例及诱导调节性T细胞的形成。10、外周血上清细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及TGF-β水平:移植+14d五组小鼠IFN-γ水平分别为:（13.62±0.59）ng/ml,（10.91±0.55）ng/ml,（6.91±0.28）ng/ml,（6.78±0.44）ng/ml及（19.85±1.05）ng/ml。IL-2水平分别为:（14.52±1.18）pg/ml,（11.09±0.83）pg/ml,（8.35±0.61）pg/ml,（8.46±0.83）pg/ml及（20.40±51.92）pg/ml。IL-4水平分别为:（7.41±0.54）pg/ml,（7.41±0.58）pg/ml,（7.32±0.43）pg/ml,（7.47±0.56）pg/ml及（4.83±0.62）pg/ml。TGF-β水平分别为:（8.36±0.68）pg/ml,（10.90±1.42）pg/ml,（16.69±0.93）pg/ml,（16.46±0.82）pg/ml及（5.69±0.71）pg/ml。MSCs共移植组与单纯allo-HSCT小鼠比较均具有统计学意义。除IL-4水平在各MSCs共移植组中无明显差异外（P＞0.701）,其余各细胞因子水平在各MSCs共移植组间比较均有显著差别,并与MSCs移植数量呈相关关系。LinearRegression逐步回归统计分析提示:IL-2水平与aGVHD评分的线性数量关系有统计学意义,IL-2水平越高,aGVHD评分越高（P=0.000）,其余各细胞因子水平对aGVHD评分无显著性影响。表明MSCs通过降低Th1分泌的IFN-γ、IL-2水平及提高Th2分泌的TGF-β浓度,降低共移植组Th1/Th2比值,促进T细胞由Th1向Th2极化。11、MSCs对小鼠移植后肿瘤生长的影响:本实验成功制备小鼠黑色素瘤动物模型,各组成瘤率达100%。A～F组小鼠肿瘤出现时间分别为:（8.25±0.50）d,（8.75±0.50）d,（8.75±0.96）d,（8.75±0.50）d,（6.75±0.50）d,（5.75±0.50）d及（5.25±0.96）d。肿瘤体积分别为:（2.187±0.196）cm³,（2.193±0.148）cm³,（2.142±0.180）cm³,（2.178±0.169）cm³,（2.153±0.077）cm³,（10.947±0.328）cm³及（8.434±0.631）cm³。各allo-HSCT组受鼠肿瘤出现时间明显延迟,且肿瘤大小均比同期非移植对照组显著缩小;MSCs共移植组较单纯allo-HSCT有效延迟肿瘤发生,但肿瘤大小共输注MSCs与单纯allo-HSCT组间比较无明显差异,考虑在实验剂量范围内输注不同来源MSCs对GVT效果影响较小。四、讨论目前有关受体免疫功能是否影响MSCs在体内归巢与植入的研究较少。照射、化疗、免疫抑制剂等因素被认为能够促进MSCs的归巢以及向组织特异性细胞的分化,但具体机制尚不清楚。我们通过比较不同时间段正常同基因小鼠及裸鼠SRY基因表达水平发现,当MSCs输注至正常免疫功能同基因受体时,绝大部分细胞均被免疫系统所识别继而排斥,2w后未再检测到供者来源MSCs表达。而在实验观察期内各裸鼠脏器组织均能检测出SRY基因表达,且表达水平与同基因组小鼠同期相比明显增强,尤其以造血、免疫器官表达显著,6w后仍可检测到SRY基因在裸鼠体内的多脏器分布。本实验结果与文献报道相符,MSCs在正常与免疫缺陷受体中的分布、定居及迁移方面存在差异,其植入细胞量及时间与受体免疫功能密切相关,推测可能是植入的MSCs在免疫缺陷环境下易被诱导扩增,通过释放多种趋化因子或粘附分子增强MSCs粘附性及归巢能力。现时预防及治疗GVHD的措施主要是大量应用细胞毒药物及免疫抑制剂,虽然可有效降低GVHD的发生,但同时也削弱GVT效应,加重移植后患者的免疫缺陷程度,使移植后感染及肿瘤复发率明显提高。我们通过构建小鼠MHC不相合allo-HSCT荷瘤动物模型共输注第三方或供者来源MSCs后发现,MSCs共移植组小鼠造血恢复时间明显早于单纯allo-HSCT组,支持MSCs促进植入,加快造血重建的说法。本研究还发现MSCs造血重建的作用与其细胞量呈正相关,而供者及第三方MSCs作用无明显差异,即作用效果与MSCs来源无关。在体外、实验动物模型及临床前期的研究显示:MSCs与造血干细胞共移植能降低allo-HSCT后GVHD的发生率和程度。本实验各MSCs共移植组小鼠GVHD发生时间均较allo-HSCT组小鼠明显延迟,且病变程度减轻,小鼠存活时间显著延长,与相关文献报道相符。本实验通过应用FACS定期检测受鼠外周血T淋巴细胞亚群发现MSCs共移植组CD4⁺/CD8⁺比值及CD4⁺CD25⁺细胞比例均高于allo-HSCT组,并呈剂量依赖性。由此推测MSCs治疗GVHD机理可能与改变外周血中CD4⁺/CD8⁺比例及诱导调节性T细胞的形成有关。本研究发现各allo-HSCT组受鼠肿瘤出现时间明显延迟,且肿瘤体积较同期非移植对照组显著缩小,提示GVHD与GVT效应之间的关联性。有报道通过ALL小鼠模型进行MSCs与HSC共移植实验,发现MSCs明显减轻GVHD的同时,对GVT作用抑制不明显。目前其他类似的体内实验研究尚少。本研究中共输注MSCs组与单纯allo-HSCT肿瘤大小比较无明显差异,表明在实验剂量范围内输注不同来源MSCs对GVT效果影响较小,与相关文献相符;但共输注MSCs较单纯allo-HSCT能够有效延迟肿瘤发生,考虑可能与MSCs具有直接抗肿瘤作用有关。本研究通过共输注第三方KM小鼠MSCs后研究发现,其在促进受鼠造血重建、减轻GVHD方面表现出与同种MSCs的一致性,并且在一定剂量范围内只减轻GVHD而不显著抑制GVT效应。在动物实验水平提示MSCs能够作为一种通用型的细胞制剂,具有促进免疫重建、减轻GVHD及保留GVT效应的作用。五、结论1、MSCs输注安全,未发现有毒副作用。2、MSCs在正常与免疫缺陷受体中的分布、定居及迁移方面存在差异,其植入细胞量及时间与受体免疫功能密切相关。3、第三方或供者来源MSCs均可促进MHC不相合allo-HSCT后造血及T细胞亚群重建,作用效果与MSCs数量呈正相关但与MSCs来源无关。4、第三方或供者来源MSCs均可减轻MHC不相合allo-HSCT后aGVHD症状,受鼠GVHD发生时间显著推迟,且生存时间明显延长,其作用效果与MSCs数量有关,与MSCs来源无关。5、第三方或供者来源MSCs在减轻MHC不相合allo-HSCT后aGVHD的同时,对GVT的抑制作用不明显。