胃癌是消化道中最多见的恶性肿瘤,在恶性肿瘤致死的原因中占第二位。同其他肿瘤一样胃癌是由环境因素和遗传因素共同引起的恶性肿瘤,近年来基因多态的研究显示,胃癌的遗传易感性与免疫相关基因、酶类基因多态、癌基因和抑癌基因多态关系密切。癌基因和抑癌基因的功能变化在胃癌的发生中起着重要作用。癌基因是指细胞中发生变异的一类基因,这些基因在细胞中行使正常的生物学功能,是机体生长和发育不可缺少的,它们是细胞内对细胞的增殖和分化过程中起重要调控作用的基因。这些基因所编码的蛋白质都存在于细胞的各个组成部分中,包括细胞核、细胞质及细胞表面。抑癌基因也称作隐性癌基因,这类基因在控制细胞生长、增殖及分化过程中起着十分重要的负性调节作用,并能潜在地抑制肿瘤生长。如果抑癌基因的功能失活或出现基因缺失、突变等异常,就可能导致细胞发生恶性转化进而导致肿瘤的发生。抑癌基因的生物学功能与癌基因相反,它们两者是有机体的细胞在增殖、分化、凋亡等生命过程中的正负两类调控信号。肿瘤的发生是一个多步骤,多基因参与的生物学过程。这其中癌基因的变异以点突变、扩增和过量表达为主,抑癌基因以缺失、点突变、低表达和甲基化为多见。基因过量表达多发生在细胞癌变的起始阶段,基因点突变可能是细胞癌变起动阶段的一个主要事件,这一阶段的可逆性较大;基因扩增、重排多发生在癌变的促进阶段,癌变细胞可能开始向不同的生物学行为分化,表现出异质性从而脱离机体对其的控制。基因缺失有可能使基因组发生更严重的破坏,不仅导致癌变细胞生物学行为的多样性进一步导致癌变细胞增殖分化失控的不可逆性,促使肿瘤迅速发展。人类Runt相关转录因子3(Human Runt-Related Transcription Factor 3, Runx3)是Runt家族中新近受到广泛关注的基因,它是哺乳动物Runt家族进化的基础,其定位于人染色体1号短臂1p36上。Runt家族成员均具有含123个氨基酸RuntDomain (RD区域),Runx蛋白与Smad2、Smad3形成复合物传递TGF-β/activin信号,与人类疾病的发生密切相关。Runx3含有2个高度保守的CpG岛,其中一个大的CpG岛富含有GC启动子的特征,它位于Runx3基因启动子P2周围,能够控制Runx3基因的转录。转化生长因子(Transforming Growth Factor beta ,TGF-β)是许多细胞的有效抑制因子,其信号紊乱将导致许多肿瘤的发生。近年来研究发现,Runx蛋白可以指导TGF-β信号转导过程中激活的Smad复合物从细胞质内转入细胞核内特定的靶位点,加强Smad复合物与靶位点的结合强度并激活靶基因,从而对细胞的分化、细胞周期调控、凋亡和恶性转化起作用。目前研究发现消化道肿瘤如胃癌、胆管癌、胰腺癌和肝细胞癌中均有染色体1p36异常。因此作为一种新的候选肿瘤抑制基因,Runx3正在受到越来越广泛的关注。有研究结果发现Runx3基因对胃癌细胞的生长有明显的抑制作用,并能阻止其在裸鼠体内的致瘤性。而敲除掉Runx3基因则会使鼠胃粘膜发生异常增生。用原位杂交技术发现在人正常胃粘膜上皮细胞存在Runx3基因的表达,而大约60%的胃癌组织中Runx3基因失活,而且与胃癌的分期有关。因此,有人认为Runx3基因是一种新发现的抑癌基因,在胃癌的发生发展过程中起着重要作用。据此,本研究以手术切除的胃癌及正常组织、胃癌细胞株SGC-7901以及荷瘤裸鼠为研究对象,应用细胞培养、动物实验、免疫组织化学、病理形态学观察、逆转录-多聚合酶链反应( Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR )、Western-Blot和甲基化特异性PCR ( Methylation-Specific PCR, MSP )等方法,对胃癌及正常组织、胃癌细胞株以及荷瘤裸鼠瘤组织中Runx3基因的mRNA表达和功能变化及甲基化状态,并用去甲基化药物5-Aza-CdR对Runx3基因启动子区域甲基化状态进行干预观察处理后该基因mRNA表达情况及裸鼠体内成瘤性进行研究,旨在探讨胃癌组织中Runx3基因的特异性表达改变及其启动子区域甲基化状态与胃癌发生、发展的关系以及Runx3基因作为候选的抑癌基因在胃癌基因治疗中的作用和机制,为胃癌患者早期特异性诊断和预后判断及去甲基化药物干预治疗提供客观的观察指标,并为开展胃癌的基因治疗提供理论和动物实验基础。第一部分胃癌组织中Runx3蛋白表达与其临床生物学行为关系的研究目的:研究人类Runt相关转录因子3(Runx3)在胃癌组织和正常组织中的表达及其意义,探讨Runx3在胃癌组织中的异常表达及其表达与胃癌临床生物学行为之间的关系。方法:采用免疫组化过氧化物酶标记链霉卵白素法(SP)对50例胃癌组织及5cm以外的正常组织中Runx3的表达进行检测并结合患者的年龄、性别、肿瘤大小、部位、分化程度、组织学类型、淋巴结转移等临床病理因素进行综合分析。结果:Runx3蛋白免疫阳性产物为棕黄色,Runx3蛋白阳性着色定位于细胞核。Runx3蛋白在胃癌中低表达,其阳性率分别为42.00%(21/50),并与肿瘤的分化程度呈反比,高、中分化癌,其Runx3蛋白的阳性率为66.67%(12/18),低分化癌其Runx3蛋白的阳性率为28.13%(9/32)两者相比差异有显著性(P<0.01)。有淋巴结转移的胃癌,其Runx3蛋白的阳性率为20.69%(6/29),无淋巴结转移的胃癌阳性率为71.43%(15/21),两者相比差异有显著性(P<0.01)。Runx3蛋白在正常组织中高表达,正常组织内阳性率为93.33%(28/30),正常组织与癌组织的Runx3蛋白的阳性率差异有显著性(P<0.05)。Runx3蛋白的表达与患者的性别、肿瘤大小等因素均无关(P>0.05)。结论:Runx3蛋白在胃癌组织中呈阴性或弱阳性表达而在正常组织中呈现强阳性表达;经临床病理资料分析认为Runx3蛋白在胃癌组织中低表达状态和肿瘤的分化程度、淋巴结转移密切相关,而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小、浸润深度、大体分型、TNM分期无统计学相关性。在低分化肿瘤和伴有淋巴结转移的胃癌组织中Runx3蛋白呈现明显低表达状态;Runx3基因可能作为抑癌基因对胃癌发生有负性调节作用,Runx3基因的表达异常及缺失会导致胃癌的侵袭性增高和淋巴结转移。第二部分胃癌中Runx3 mRNA和蛋白的表达及其基因启动子甲基化的研究目的:探讨Runx3基因mRNA及其蛋白在胃癌与正常胃粘膜组织中的表达差异以及Runx3基因启动子区域甲基化状态在不同组织中的表达状态,进一步研究甲基化状态与基因表达之间的关系。方法:采用RT-PCR、Western-Blot和MSP技术对临床60例胃癌新鲜标本及其周围正常粘膜组织中Runx3基因和蛋白的表达以及Runx3基因启动子甲基化情况进行检测,并对其表达与临床生物学行为的关系进行分析。结果:1 Runx3 mRNA在胃癌和正常粘膜组织中的表达:Runx3和GAPDH引物的扩增基因片段经电泳和EB染色后,结果显示在正常粘膜组织中78.33%(47/60)可见清晰的电泳条带,而在胃癌组织中只有25.00%(15/60)可见电泳条带并且条带较淡,扩增片段大小与所设计的大小完全一致,分别为353bp和208bp。Runx3表达量相对值在胃癌组织和正常粘膜组织中分别是(0.58±0.11)和(0.83±0.30),两者统计学差异显著(t=6.1435,P<0.01)。2 Runx3蛋白在胃癌和正常粘膜组织中的表达:Runx3蛋白在胃癌的表达与正常粘膜组织中比较蛋白表达量显著下降。Runx3蛋白积分光密度在胃癌组织和正常粘膜组织中分别为(6719.01±343.29)和(36752.51±1205.68)。这种表达差异有显著性统计学意义(t=23.9579,P<0.01)。3 Runx3基因启动子甲基化在胃癌和正常组织中的发生率:Runx3基因甲基化检测电泳染色后结果发现,正常组织内未发现Runx3基因启动子甲基化而胃癌组织标本中有53.33%(32/60)被检测到。并且Runx3基因启动子在胃癌组织中的高甲基化状态与Runx3 mRNA低表达有负相关(r=-0.4915,P<0.01 )。4 Runx3的表达与胃癌临床病理相关因素的关系:Runx3的表达与胃癌临床病理相关因素的关系结果显示, Runx3 mRNA的表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05),而与性别、肿瘤大小无关(P>0.05)。结论:Runx3 mRNA及其蛋白在胃癌组织中的表达量明显低于正常组织。Runx3基因的表达异常在胃癌的发生发展过程中起着重要作用。Runx3基因启动子在胃癌组织中的高甲基化状态与Runx3 mRNA低表达有负相关。Runx3基因启动子甲基化是该基因的表达异常的主要原因。Runx3 mRNA的表达与胃癌的分化程度及淋巴结转移有关,而与性别、年龄、肿瘤大小、部位、大体分型、TNM分期均无关。第三部分5-Aza-CdR对人胃癌SGC-7901细胞生长及其Runx3 mRNA表达影响的实验研究目的:采用RT-PCR、MTT、细胞增殖曲线和流式细胞术(FCM)等技术对人胃癌细胞株SGC-7901细胞经药物去甲基化前后Runx3 mRNA再表达情况以及去甲基化药物对人胃癌细胞株SGC-7901生长及凋亡的影响进行检测,并对Runx3 mRNA的再表达和其启动子区域甲基化状态变化进行分析,从而进一步阐明胃癌发生发展过程中的Runx3基因失活机理及其分子生物学基础。方法:常规方法培养人胃癌细胞株SGC-7901传代、冻存。取对数生长期细胞作为研究对象,在细胞传代时随机分组,并在实验组细胞培养时加入5-Aza-CdR对细胞进行去甲基化处理。观察不同处理组细胞的生长状态,记录细胞生长曲线,采用RT-PCR和FCM检测实验组和对照组细胞中Runx3 mRNA的表达及其胃癌细胞凋亡率。结果:1去甲基化药物对人胃癌SGC-7901细胞株细胞生长的影响:显微镜下观察细胞形态学变化,经去甲基化处理的实验组细胞,经HE染色后观察其细胞出现细胞核固缩,染色质凝集,呈新月型紧贴于核膜周边,核碎裂,染色质片断化,有凋亡小体形成等典型的细胞凋亡特征。由细胞增殖曲线可以看出去甲基化药物对胃癌细胞株生长有明显地抑制作用,并且随着时间和浓度的增加差别也越明显。2去甲基化药物对人胃癌SGC-7901细胞株细胞凋亡率的影响:经流式细胞仪检测分析结果显示,未经去甲基化处理的对照组细胞凋亡率为2.59%,经5-Aza-CdR药物处理后的实验组胃癌细胞在细胞周期G1峰前出现了明显的凋亡峰,细胞凋亡率分别为1μmol/L组(10.42±0.30)%、5μmol/L组(20.87±0.95)%与对照组(2.59±0.12)%相比有明显的统计学意义。3去甲基化药物处理前后人胃癌细胞株SGC-7901细胞内Runx3 mRNA表达变化:RT-PCR检测未经去甲基化处理的胃癌细胞株细胞内未发现Runx3 mRNA的表达,而经过5-Aza-CdR药物行去甲基化处理后的实验组胃癌细胞内其Runx3基因得到重新表达,其表达量为(0.42±0.02),与对照组(0.19±0.01)相比有明显的统计学意义。结论:去甲基化药物对胃癌细胞株生长有明显地抑制作用,并且随着时间和浓度的增加差别也越明显。经5-Aza-CdR药物处理后的实验组胃癌细胞与未经去甲基化处理的对照组细胞比较其细胞周期G1峰前出现了明显的凋亡峰,细胞凋亡率增高。人胃癌细胞株SGC-7901细胞经去甲基化药物5-Aza-CdR行去甲基化处理后,重新呈现Runx3 mRNA的表达,提示Runx3基因启动子区域甲基化是使该基因失活的重要原因,祛除甲基化状态后该基因得到重新表达并且去甲基化药物对人胃癌细胞株SGC-7901细胞生长有抑制作用,能够促进其发生凋亡。第四部分荷去甲基化SGC-7901胃癌细胞裸鼠成瘤性及其Runx3 mRNA表达变化的研究目的:本实验采用细胞培养技术对人胃癌细胞株SGC-7901细胞进行体外培养,在培养同时进行胃癌细胞的去甲基化处理,将实验组和对照组细胞分别接种到BALB/c裸鼠皮下,观察经不同处理后的人胃癌细胞株SGC-7901细胞在裸鼠体内的成瘤性差异,同时采用RT-PCR技术对人胃癌细胞株SGC-7901细胞经药物去甲基化前后在裸鼠成瘤组织内Runx3 mRNA再表达情况进行检测,对人胃癌细胞株SGC-7901细胞经药物去甲基化前后在裸鼠体内生物学性状进行分析,从而进一步阐明启动子区域甲基化导致的Runx3基因失表达的分子生物学基础,提供临床应用去甲基化药物治疗胃癌的体内实验基础资料。方法:24只雌性BALB/c裸鼠随机分为实验组(n=12)和对照组(n=12)。培养人胃癌细胞株SGC-7901细胞,取生长对数期细胞作为研究对象,随机分为实验组和对照组,在接种裸鼠前实验组细胞经5-Aza-CdR药物行去甲基化处理,两组细胞分别接种裸鼠左侧腋窝中部外侧皮下,观察裸鼠一般生长情况至皮下成瘤;荷瘤小鼠成瘤后观察肿瘤发生率并测量肿瘤体积比较实验组和对照组瘤体积差异,采用RT-PCR检测瘤组织中Runx3 mRNA的再表达情况。结果:1荷瘤鼠肿瘤体积:两组荷瘤鼠一般反应良好,试验组和对照组裸鼠成瘤率分别为66.7%和100%;第5周末对照组和实验组荷瘤鼠的肿瘤体积分别为(1178.98±228.00)mm3和(560.65±173.92)mm3(t=4.8215,P﹤0.01)。2两组荷瘤鼠瘤组织标本中Runx3 mRNA表达:Runx3和GAPDH引物的扩增基因片段经电泳和EB染色后,结果显示在药物处理组和未经药物处理组中都可见电泳条带,扩增片段大小与所设计的大小完全一致,分别为353bp和208bp。Runx3表达量相对值在实验组和对照组分别是(0.39±0.04)和(0.22±0.02),试验组表达量显著高于对照组(t=4.4275,P﹤0.01)。结论:经动物体内试验验证Runx3基因启动子高甲基化是导致该基因mRNA缺失表达的主要原因之一,其高甲基化状态可以应用去甲基化药物5-Aza-CdR作用而发生改变,去甲基化药物5-Aza-CdR对动物体内胃癌细胞成瘤性有明显的抑制作用,提示经去甲基化处理后的Runx3基因可出现重新表达从而对胃癌细胞的生长有明显抑制作用。