铁几乎是所有细胞和有机体的重要组成成分之一。近年来,有关铁过载及其负生理效应已引起越来越多的关注。铁过载导致的负效应,除了公认的铁介导产生的·OH自由基致细胞器官机能障碍学说外,铁介导的蛋白质硝化导致蛋白质和DNA受损,从而对蛋白质功能的影响,也激起了人们广泛的研究兴趣。与此同时,研究合适的方法检测蛋白质酪氨酸硝化后的稳定产物3-NT,及 NO的代谢产物NO2-和NO3-,也为揭示体内与NO相关问题的研究打下基础。本文从研究铁过载和蛋白质硝化关系出发,进一步研究了铁卟啉介导的蛋白质硝化后对其功能的影响,并建立了毛细管电泳法检测与蛋白质硝化相关物种(3- NT、NO2-、NO3-)的方法。主要内容包括以下几个方面:　　1)选用成年雄性小鼠,采用腹腔注射100 mg/kg(体重bw)浓度为20 mg/mL的右旋糖苷铁(5次)的方法建立铁过载小鼠模型,与腹腔注射同体积的生理盐水(5次)的正常小鼠对照,对其一些基本的生化指标进行检测,结果显示,小鼠铁过载模型动物中的一些与氧化应激相关的生化指标,如肝体比;脾体比;血清中铁及铁蛋白含量;三种组织(肝脏、肾脏、心脏)中铁含量;三种组织中脂质过氧化产物 MDA含量以及羰基含量显著增加( p<0.01),表明已造成铁过载模型。利用肝组织切片染色法,也清晰地发现肝上大量的铁沉积。并且首次发现了铁过载情况下,肝中蛋白质硝化的情况总体上高于正常小鼠,且有一些新的被硝化蛋白条带的出现(约57kD,35 kD),说明铁过载导致了体内蛋白质硝化选择性的改变。　　2)NaNO2-H2O2-氯高铁原卟啉(hemin)体系对酪氨酸的硝化,被认为是体内导致酪氨酸硝化的原因之一。因此通过选用肝中重要的酶之一——异柠檬酸脱氢酶(ICDH)为研究对象,研究铁过载时ICDH失活的可能性以及蛋白质硝化对其失活的贡献。采用NaNO2-H2O2-hemin体系引起蛋白质硝化和氧化,通过加NO2-来调控硝化。研究结果表明:0.5 mM H2O2-1 mM NaNO2-10mM hemin体系可导致ICDH活性降低45％,而其中大约有15%的贡献来自NO2-;在H2O2和hemin存在下,NO2-剂量依赖性地导致ICDH发生酪氨酸硝化,同时,也剂量依赖性地导致ICDH活性降低;ICDH在不同 pH条件下用H2O2-NaNO2-hemin体系处理后的活性变化结果表明,当pH高于7.0时,蛋白质氧化断裂程度增大,而 pH低于7.0时,蛋白质酪氨酸硝化程度增强。相应地,ICDH经 H2O2-NaNO2-hemin处理后,其活力在pH7.0时高于其在pH6.0和pH8.0时的活力,表明氧化和硝化均是导致ICDH活力显著降低的因素。　　3)许多与NO代谢失常相关的疾病患者尿液中都可见NO2-和NO3-含量的异常,铁过载疾病中有 NO过量产生的可能,但其尿液中的NO2-和NO3-含量是否异常尚无研究报道。通过改进的毛细管区带电泳法(CZE)测定了铁过载小鼠尿液中的NO2-和NO3-含量,结果显示该方法的灵敏度优于其它同类方法;精密度和准确度都符合分析的要求;铁过载小鼠尿液中的NO2-和NO3-含量均大于正常小鼠尿液中的含量,但仅NO3-含量之间有显著性差异。　　4)首次利用毛细管胶束电动色谱在线高盐堆积技术研究NaNO2-H2O2-hemin-酪氨酸(tyrosine)体系中3-NT的测定,建立了一种新的测定生物样品中微量3-NT的方法。最佳分离条件为含SDS(30 mmol/L)的硼砂(36 mmol/L)缓冲液(pH9.3),进样压力为0.5 psi,进样时间为30s,毛细管柱温度25℃,分离电压20 KV,样品中NaCl(100 mmol/L)。在此条件下,3-NT的检出限为0.1mmol/L(S/N=3);线性范围为0.78~50mmol/L;线性相关系数为0.9953。保留时间日内与日间的RSD(n=5)分别为1.6%和2.8%,加标回收率为95.2~103.1%,样品不同浓度添加水平的日内和日间的RSD(n=5)均小于3%。该方法简单、快速、灵敏度高,为直接分析生物样品中的微量3–NT提供了一种方法。