论文部分内容阅读
弓形虫是一种专性细胞内寄生性原虫,属于顶复门,是引起人兽共患弓形虫病的一种重要病原。弓形虫病是人和哺乳动物感染率较高的寄生虫病。目前临床治疗弓形虫病的药物十分有限,迫切需要寻找新的药物靶点,用以研发治疗弓形虫病的新的药物。顶质体在弓形虫体内发挥着极其重要的功能,如参与合成脂肪酸、血红素和类异戊二烯等弓形虫生长所必须的营养物质。顶质体功能受损会导致虫体死亡。因此顶质体一直被视为理想的治疗弓形虫病的药物靶点。甲硫氨酸氨基肽酶能够切除新生肽链N端起始的甲硫氨酸,在甲硫氨酸的代谢、蛋白质N端的翻译后修饰、蛋白质成熟等过程中发挥着重要的功能。甲硫氨酸氨基肽酶在很多人类疾病中作为重要药物靶点得到了广泛研究,然而弓形虫甲硫氨酸氨基肽酶能否作为治疗弓形虫病的药物靶点还尚未可知。本研究首先通过生物信息学分析对弓形虫甲硫氨酸氨基肽酶进行鉴定。在虫体内过表达弓形虫甲硫氨酸氨基肽酶,通过激光共聚焦显微镜观察其在虫体内的定位情况,发现弓形虫编码的三个甲硫氨酸氨基肽酶(TgMAP1a/b、TgMAP2)定位于虫体胞浆,而TgMAP1c定位于顶质体。为进一步探究TgMAP1c在弓形虫顶质体上发挥的功能,首先利用虫体内源性插入的方法成功构建了TgMAP1c-3HA虫株,在该虫株的基础上利用虫体内源性插入的方法与Tet-off蛋白表达调控系统成功构建了TgMAP1c条件性缺失虫株(iTgMAP1c虫株)。通过噬斑实验、复制实验、入侵实验、荧光定量PCR实验以及动物实验分析了TgMAP1c条件性缺失对弓形虫的的影响。实验结果表明:条件性缺失TgMAP1c导致弓形虫生长复制水平受到抑制、顶质体丢失和毒力减弱。进一步分析发现,TgMAP1c缺失的虫株的顶质体基因组转录水平受到了抑制。综上所述,TgMAP1c在弓形虫顶质体的维持和生物发生过程中起着关键作用。因此,TgMAP1c可能是治疗弓形虫病的潜在药物靶点。