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木豆作为豆科木豆属植物,具有重要的药理作用,芪类和黄酮类是其主要活性成分,在医疗保健领域被人们广泛重视。本课题主要进行木豆叶总黄酮的酶辅助提取工艺及其活性单体牡荆苷对成骨细胞MC 3T3-E1生物学作用的研究。首先建立纤维素酶辅助提取木豆叶总黄酮的提取工艺,检测木豆总黄酮提取液中牡荆苷含量,为木豆黄酮类成分的开发利用奠定基础;利用成骨细胞体外模型MC 3T3-E1,系统研究了木豆总黄酮及其活性单体牡荆苷对成骨细胞MC 3T3-E1的增殖、分化、矿化作用,结果如下:1.本文以木豆叶为原料,首次利用纤维素酶破坏细胞壁,增加总黄酮得率,并借助响应面法对其各影响因素进行优化,确定最佳提取工艺参数其结果如下:纤维素酶量:8.65 mg;酶解温度:33.88 ℃;酶解时间:2.02 h;酶解pH:5.02;提取次数:3次;乙醇浓度:80%;料液比:1:100;实际总黄酮得率:4.86%。2.建立了木豆叶总黄酮中牡荆苷的HPLC检测条件为:色谱柱:HiQ Sil C18W(4.6 mm I.D.×250 mm);流动相:乙腈-1%乙酸水溶液(20:80);检测波长:332 nm;流速:1 mL/min;柱温:25 ℃;进样量:10μL;此条件下检测木豆叶总黄酮提取液中牡荆苷含量0.2%。3.运用MTT法研究牡荆苷、木豆提取物对成骨细胞MC 3T3-E1细胞增殖作用的影响,发现在不同时间牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对MC 3T3-E1均有不同程度促进增殖作用:(1).在牡荆苷浓度1×10-10μg/mL～1×10-1μg/mL范围内,对成骨细胞MC3T3-E1分别作用24 h、48 h和72 h时,随着给药剂量的增加,增殖效果明显加大,浓度范围在1×10-10μg/mL～1×10-6 μg/mL时,其增殖效果大于1×10-5 μg/mL～1×10-1 μg/mL。药物对MC 3T3-E1分别作用24h、48h和72h时,均能不同程度的促进MC3T3-E1的增殖、生长。(2).牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物在浓度范围1×10-10 μg/mL～1×10-6 μg/mL内,对成骨细胞MC3T3-E1分别作用24h、48h和72h,对MC3T3-E1具有一定的增殖作用,其中在浓度为1×10-8 μg/mL时,对成骨细胞的增殖效果最明显。其中在24h时牡荆苷组细胞增殖率达到37.52±0.34%,木豆叶总黄酮提取物达到46.17±0.76%;在48 h时牡荆苷组细胞增殖率达到62.17±1.34%,木豆叶总黄酮提取物达到55.54±2.47%;在72 h时牡荆苷组细胞增殖率达到38.54±0.52%,木豆叶总黄酮提取物达到36.49±0.82%。并且在一定浓度下呈浓度依赖性。4.采用比色法对牡荆苷、木豆叶总黄酮提取物对成骨细胞MC 3T3-E1分化效果进行研究,发现牡荆苷、木豆叶总黄酮提取物对细胞的分化有一定的促进作用。药物对成骨细胞分别作用3d、5d、7d时,牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物浓度为1×10-8μg/mL时对成骨细胞促进分化效果最明显,且在一定范围内与作用时间及浓度呈依赖关系。5.采用MTT法检测牡荆苷、木豆提取物对地塞米松逆转MC 3T3-E1增殖效果,结果在诱导后分别加入牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物处理,发现细胞增殖率均高于模型组,当牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物浓度为1×10-8 μg/mL且对成骨细胞作用72 h后,牡荆苷组细胞增殖率达到45.36±4.19%;木豆叶总黄酮提取物组细胞增殖率达到52.47±2.55%;表明牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对地塞米松均有一定的逆转作用,并存在浓度依赖性。6.运用比色法对MC 3T3-E1细胞内ALP含量检测,结果在诱导后分别加入木豆叶总黄酮提取物及牡荆苷发现细胞内ALP含量在对照组与模型组之间且大于模型组小于对照组。其中牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物浓度为1×10-8μg/mL且对成骨细胞作用72 h后,牡荆苷组ALP含量为17.04±0.54%,木豆叶总黄酮提取物组ALP含量为15.06±0.27%。说明在一定浓度下地塞米松能抑制其分化。7.采用Von Kossa染色法对成骨细胞MC3T3-E1矿化结节数进行分析,结果对于同一组处理的细胞矿化结节个数随着加药时间的延长而增加,其中牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对成骨细胞分别作用28 d时,牡荆苷组及木豆叶总黄酮提取物组结节个数均多于空白对照组。说明牡荆苷及木豆叶总黄酮提取物对地塞米松诱导后的成骨细胞MC3T3-E1有逆转作用,并在一定剂量内存在时间依赖性。