甲氨蝶呤联合环磷酰胺对大鼠毒副作用和细胞周期、DNA损伤作用机制的长期实验研究【研究背景和目的】类风湿关节炎(RA)是高度致残性自身免疫性疾病,改善病情抗风湿药物(DMARDs)的联合用药仍然是RA治疗的主流。传统的DMARDs联合有:甲氨蝶呤(MTX)+来氟米特(LEF),疗效肯定,但它们同属细胞周期特异性药物,均作用于细胞周期的S-期,同类药物之间的联合效率不高,且副作用相近,限制了它们的联合。有些联合治疗方案非常有效,如:环磷酰胺(CTX)+硫唑嘌呤(AZA)+羟基氯喹(HCQ),它们作用于不同的细胞周期,可能有协同作用。但由于CTX每日口服,以致毒副作用明显,患者不能耐受长期治疗,极大地限制了在RA中的应用。由于RA的治疗是长期的,故探索新的联合治疗方案不仅要考虑其疗效,减少药物的副作用,提高患者的依从性更应该引起重视。由于RA有许多类似肿瘤的特点,如滑膜细胞和淋巴细胞的细胞周期失控、凋亡异常等。近年来,造血干细胞移植、抗CD20单克隆抗体治疗难治性RA,均是源于血液病治疗的成功经验。肿瘤联合化疗的理论依据是选用作用于不同细胞周期的药物进行联合。鉴于此,我们在治疗RA的临床实践中,依据肿瘤联合化疗的理论,联合细胞周期特异性药物(MTX)与周期非特异性药物(CTX)小剂量间歇给药治疗RA,回顾性分析资料显示联合组较小剂量单用药组疗效显著(缓解率80%),而副作用无明显增加。分析我们实验性治疗RA疗效好、副作用小的原因:首先,根据细胞动力学原理,选用作用于不同细胞周期的药物进行联合,减少了单用药的剂量。其次,CTX采用小剂量、间歇给药。MTX是细胞周期特异性药物,主要作用于S期,对G0/G1→S期转换有延缓作用。CTX是双功能烷化剂,属细胞周期非特异性药物,对G0期和增殖各期细胞均有杀伤作用。我们推测,每周给与小剂量MTX将多数细胞阻滞在G0/G1期。在此基础上,每3周给予小剂量CTX,可能更有效杀伤阻滞于G0/G1期的细胞,同时给正常细胞恢复时间,大大降低了毒副作用。检索国内外文献,目前尚无根据细胞动力学原理联合免疫抑制剂治疗RA的理念。基于以往临床实践的基础,我们设计了本研究。由于RA的治疗是长期的,而RA相关的关节炎大鼠模型在给药后存活期难以保证。所以为了验证长期给药后联合方案的毒副作用及联合作用机制,我们对正常大鼠进行了长达27周的实验研究。研究目的:①通过检测不同剂量MTX、CTX单独或联合用药后对血常规、肝、肾功能和相应脏器病理变化的影响,探讨联合方案的毒副作用。②应用单细胞凝胶电泳技术(SCGE),以彗尾长度和慧星频率作为观测指标,检测不同剂量MTX、CTX单独或联合用药后对大鼠肝脏、肾脏细胞的DNA损伤,进一步探讨联合组的毒副作用机制。同时检测对大鼠PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞的DNA损伤,探讨MTX、CTX可能的联合作用机制。③通过流式细胞术(FCM)检测脾脏、骨髓及PBL在细胞周期的各期细胞比例及G1期细胞周期蛋白(cyclin)D1,探讨联合方案对脾脏、骨髓、PBL细胞周期和cyclin D1的影响是否具有协同作用,探讨是否通过影响脾脏、骨髓、PBL的cyclin D1途径实现对细胞周期的影响。【材料和方法】对毒副作用和DNA损伤作用的研究:取180只健康Wistar大鼠随机分为六个实验组:正常对照组、联合组(小剂量MTX+小剂量CTX间歇给药)、小剂量MTX组、小剂量CTX组(CTX间歇给药组)、大剂量MTX组、大剂量CTX组(CTX隔日给药组)。对细胞周期有关机制的研究:取四个实验组:正常对照组、小剂量MTX组、小剂量CTX组、联合组。MTX采用灌胃法,CTX隔日给药采用灌胃法,CTX间歇给药采用腹腔注射。给药剂量根据参考文献的大鼠给药公式计算。小剂量MTX组:相当于临床治疗RA患者给与MTX每周10mg口服;小剂量CTX组:相当于临床治疗RA患者给与CTX每3周400mg静脉给药:大剂量MTX组相当于临床治疗RA患者给与MTX每周20mg口服:大剂量CTX组:相当于临床治疗RA患者给与CTX200mg隔日口服。在给药前、给药后3周、9周、18周、27周后(5个时点)分别采血,检测血常规、肝功能、肾功能;SCGE检测PBL的DNA损伤;流式细胞仪三色分析法,分析PBL的cyclinD1的表达及细胞周期变化。给药后3周、9周、18周、27周后(4个时点)分别解剖大鼠,每组每时点解剖6只大鼠,取肝脏、肾脏脾脏,作病理切片常规HE染色观测病理变化;SCGE检测肝脏、肾脏、脾脏和骨髓细胞的DNA损伤;流式细胞仪三色分析法,分析脾脏和骨髓淋巴细胞的cyclin D1表达及细胞周期变化;免疫组化检测脾脏组织cyclin D1的表达。【结果】1.甲氨蝶呤联合环磷酰胺对大鼠肝、肾、血液毒副作用的影响(1)对一般情况的影响①用药前各组别体重无差异,在用药3周后大剂量CTX组体重明显低于正常对照组,其余各组间无明显差异。用药9、18、27周各组间体重比较无差异。但在9周时大剂量CTX组的体重有低于其它各组的趋势。②大剂量CTX组的意外死亡大鼠数(18只)明显高于其它各组。且大剂量CTX组意外死亡均发生在18周内。其余各组间意外死亡大鼠数无统计学差异。(2)对血常规、肝肾功能的影响①用药组与正常对照组比较,白细胞和淋巴细胞计数明显下降。大剂量CTX组白细胞和淋巴细胞计数明显低于其它各组。其余各组间比较无明显差异。各解剖时点间比较无差异。对外周血红细胞和血小板的影响,不同用药组、不同解剖时点间比较均无明显差异。②不同处理组、不同解剖时点间比较ALT、AST和BUN、Cr,均无统计学差异。③经析因设计的方差分析结果显示:MTX、CTX对PBL计数的影响有协同作用,两药单独使用使PBL计数减少,联合后使PBL计数减少更加显著。(3)对脏器病理改变的影响①肝脏:大剂量CTX组肝细胞变性、水肿明显重于其它各组,而其它各组间无明显差异。间质血管扩张、充血各组间比较有统计学差异,严重程度依次为大剂量CTX组＞联合组≈小剂量CTX组＞大剂量MTX组≈正常对照组≈小剂量MTX组。肝脏淋巴细胞浸润不同组别间和不同解剖点间比较,均无统计学差异。在不同解剖时点间肝细胞变性、水肿间质和血管扩张、充血,无明显差异。②肾脏:大剂量CTX组的肾小管细胞水肿、变性明显重于正常对照组和小剂量MTX组。其它组别和各解剖时点间比较无统计学差异。肾间质血管扩张和充血在各组和各解剖点比较,均无明显差别。蛋白管型和淋巴细胞浸润在各组和各解剖点比较,均无明显差别。③意外死亡大鼠肝脏细胞水肿变性、血管扩张充血及肾脏病理改变均比较严重。(4)联合组脏器病理与功能学指标的相关性①肝脏细胞水肿、变性与ALT、AST有相关性。肝脏血管扩张充血与ALT、AST无相关性。肝脏细胞水肿变性与血管扩张充血有相关性。ALT与AST有相关性。②肾脏各病理指标与BUN、Cr无相关性。肾脏细胞水肿变性与血管扩张充血有相关性。蛋白管型与细胞水肿变性、血管扩张充血无相关性。肾脏淋巴细胞浸润与细胞水肿变性、血管扩张充血有相关性。BUN与Cr水平有相关性。2.单细胞凝胶电泳技术检测甲氨蝶呤、环磷酰胺对大鼠脏器细胞DNA的损伤(1)对肝脏、肾脏细胞彗尾长度和彗星频率的影响①肝脏细胞彗尾长度各组间比较,大剂量CTX组明显高于其它组,其余各组之间无差异。肝脏细胞彗星频率组间比较有差异,严重程度依次为大剂量CTX组≈联合组≈小剂量CTX组＞小剂量MTX组≈大剂量MTX组≈正常对照组,各解剖时点间比较,肝脏细胞彗尾长度无统计学差异。各解剖时点间比较,肝脏细胞彗星频率用药18周和27周明显高于第3周。②肾脏细胞彗尾长度各组间比较,大剂量CTX组明显高于其它组,其余各组别之间无统计学差异。肾脏细胞彗星频率组间比较有统计学差异,严重程度依次为大剂量CTX组≈小剂量CTX组≈联合组＞小剂量MTX组≈正常对照组,联合组与大剂量MTX组比较无统计学差异。大剂量MTX组与小剂量MTX组和正常对照组比较无统计学差异。各解剖时点间比较,肾脏细胞DNA损伤无统计学差异。(2)对PBL、脾脏、骨髓细胞彗尾长度和彗星频率的影响①PBL彗尾长度、彗星频率各组间比较均有统计学差异,彗尾长度严重程度依次为大剂量CTX组＞联合组＞小剂量CTX组＞大剂量MTX组≈正常对照组≈小剂量MTX组。彗星频率严重程度依次为大剂量CTX组＞联合组≈小剂量CTX组＞大剂量MTX组≈正常对照组≈小剂量MTX组。各解剖时点间比较,PBL DNA损伤无统计学差异。②脾脏、骨髓细胞彗尾长度、彗星频率各组间比较均有明显差异,彗尾长度严重程度依次为大剂量CTX组＞联合组≈小剂量CTX组＞大剂量MTX组＞正常对照组≈小剂量MTX组。彗星频率严重程度依次为大剂量CTX组＞联合组≈小剂量CTX组＞大剂量MTX组≈小剂量MTX组≈正常对照组。各解剖时点间比较,脾脏、骨髓细胞DNA损伤无差异。(3)联合组不同脏器细胞SCGE结果的相关性及PBL SCGE结果与PBL计数的相关性PBL和不同脏器细胞彗尾长度之间、彗星频率之间呈正相关。PBL计数与PBL彗尾长度、彗星频率呈明显负相关,即PBL的DNA损伤越严重,PBL计数越少。PBL的彗尾长度、彗星频率与肝脏细胞水肿、变性和血管扩张、充血有明显相关性,与肾脏细胞水肿、变性有明显相关性,与肾血管扩张、充血及生化指标之间无相关性。(4)不同脏器之间DNA损伤的比较彗尾长度、彗星频率在肝脏和肾脏细胞之间、在PBL、骨髓、脾脏之间无统计学差异。但对PBL、骨髓、脾脏细胞彗尾长度、彗星频率的影响远大于肝脏、肾脏细胞。3.甲氨蝶呤联合环磷酰胺对大鼠脾、骨髓、PBL细胞周期和周期蛋白D1的作用(1)对PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞细胞周期的影响和两药的交互作用①小剂量MTX组使PBL的S期细胞比例明显低于正常对照组。小剂量CTX和联合组使PBL细胞周期各期细胞比例发生小幅度变化。与正常对照组对细胞周期的影响无统计学差异。②与正常对照组比较,联合组使骨髓、脾脏淋巴细胞G0/G1期细胞比例明显降低、S期细胞比例明显升高。单独用药组间对G0/G1期和S期细胞比例的影响无明显差异。不同组别对G2/M期细胞比例的影响无差异。各解剖时点间对PBL、骨髓、脾脏细胞各期细胞比例的影响无差异。③经析因设计的方差分析,发现MTX、CTX均对PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞G0/G1期和S期细胞比例的影响有交互作用,MTX或CTX单独使用使G0/G1期细胞比例增高、S期细胞比例下降,两药联合使用后使G0/G1期细胞比例下降、S期细胞比例增高,表现为拮抗作用。MTX和CTX对G2/M期细胞比例的影响无交互作用。(2)对PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞cyclin D1的影响和两药的交互作用①对PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞的cyclin D1表达及脾脏组织免疫组化cyclin D1表达的影响,不同用药组间、不同解剖时点间比较均无统计学差异。脾脏组织cyclin D1免疫组化和流式细胞仪检测结果无明显相关性。②MTX、CTX对PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞cyclinD1及脾脏组织免疫组化检测cyclinD1的表达的影响无交互作用。(3)联合组PBL、骨髓和脾脏淋巴细胞G0/G1期细胞比例与cyclin D1相关性分析PBL、骨髓和脾脏淋巴细胞之间G0/G1期细胞比例有明显相关性。PBL、骨髓和脾脏淋巴细胞之间cyclinD1的表达有明显相关性。PBL、骨髓和脾脏淋巴细胞G0/G1期细胞比例与cyclinD1有明显负相关。PBL计数与脾脏淋巴细胞周期G0/G1期细胞比例呈正相关,与PBL、脾脏淋巴细胞周期S期细胞比例呈负相关。骨髓淋巴细胞彗星频率与骨髓G0/G1期细胞比例呈负相关,与骨髓淋巴细胞周期S期细胞比例呈正相关。脾脏淋巴细胞彗星频率与脾脏G0/G1期细胞比例有呈负相关趋势,与骨髓淋巴细胞周期S期细胞比例呈正相关趋势。【结论】1.MTX联合CTX小剂量间歇给药与单用药比较毒副作用并没有增加,比较安全。CTX隔日给药组的毒副作用明显大于其它各组。表现为体重不增、意外死亡大鼠数量明显增多、肝脏、肾脏病理变化严重。2.生化指标ALT、AST、BUN、Cr并不能及时地反映肝脏、肾脏早期病理改变。SCGE检测PBL的DNA损伤与肝脏、肾脏的DNA损伤和肝、肾病理改变有明显的相关性,初步推测可以作为检测药物副作用的敏感指标。3.CTX对PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞DNA的损伤远重于MTX。PBL的DNA损伤越严重,PBL计数越少。推测CTX通过对细胞DNA损伤引起PBL数量下降。MTX联合CTX对PBL、骨髓、脾脏淋巴细胞DNA的损伤与小剂量CTX组比较有增加趋势。4.MTX单独使用使PBL、骨髓、脾脏细胞S期细胞比例明显降低,主要通过影响细胞G0/G1→S期的转换发挥作用,进一步验证MTX为周期特异性药物。CTX单独使用对细胞各期比例影响较小,CTX作为细胞周期非特异性药物,主要通过细胞的DNA损伤发挥作用。5.MTX单独使用使G0/G1期细胞比例增高,CTX单独使用使G0/G1期细胞比例轻度增高,但两药联合使用后G0/G1期细胞比例明显下降,两药的交互作用表现为拮抗作用。推测每周给予小剂量MTX将多数细胞阻滞在G0/G1期,在此基础上,给予小剂量CTX,能更有效地杀伤阻滞于G0/G1期的细胞。从治疗角度来讲,达到了协同作用。6.MTX、CTX联合方案给药24小时对细胞周期的影响并非通过PBL、骨髓和脾脏的cyclin D1途径来实现。是否存在其它机制尚有待于进一步研究。