【摘 要】
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大头金蝇Chrysomya megacephala (Fabricius)生存环境恶劣,传播各种疾病而自身却不得病,说明其免疫系统对病菌有强大的防御能力。昆虫受到病原物侵入时,抗菌肽作为体液免疫的先锋防御因子由脂肪体细胞迅速合成并释放进入血淋巴;而热激蛋白除了以分子伴侣形式起恢复被破坏的蛋白质结构与活性而维持内环境的稳定外,还参与抗原递呈,免疫调控等功能。但是关于这两类蛋白是否同时对病原物作出响应
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大头金蝇Chrysomya megacephala (Fabricius)生存环境恶劣,传播各种疾病而自身却不得病,说明其免疫系统对病菌有强大的防御能力。昆虫受到病原物侵入时,抗菌肽作为体液免疫的先锋防御因子由脂肪体细胞迅速合成并释放进入血淋巴;而热激蛋白除了以分子伴侣形式起恢复被破坏的蛋白质结构与活性而维持内环境的稳定外,还参与抗原递呈,免疫调控等功能。但是关于这两类蛋白是否同时对病原物作出响应的关系尚未有文献报道。本文主要从大头金蝇3龄幼虫注射不同浓度大肠杆菌Escherichia coli、金黄葡萄球菌Staphyloccocus aureu和PBS缓冲液,经过不同时间后抗菌肽和热激蛋白的表达量变化作为切入点,对这两种蛋白在大头金蝇免疫防御系统中的诱导作用进行初步研究。本文克隆了大头金蝇Cecropin A和Hsp70基因的cDNA全长,命名为CM-CecA和CM-Hsp70。 CM-CecA基因cDNA全长为421bp,5’-UTR为87bp,3’-UTR为142bp,开放读码框(ORF)为189bp,编码63个氨基酸。ORF的相对分子量为6.7KD:信号肽序列为第1至23个氨基酸;1个亲水区;2个疏水区;2个α螺旋。CM-CecA在大头金蝇世代发育的6个阶段中都有表达,成虫期的表达量最高,在其他阶段的表达量相对比较稳定。CM-Hsp70基因cDNA全长为2281bp,5’-UTR为186bp,3’-UTR为136bp,开放读码框(ORF)为1956bp,编码652个氨基酸,分子质量为70KD。CM-Hsp70蛋白由三个主要结构域组成,即N端高度保守的ATP酶区,相对分子质量约44KD,下游约18KD保守的多肽结合区和C端约10KD的可变区。C端最末端特有的特异性基序EEVD,表明此蛋白质是定位于细胞质内。CM-Hsp70在卵的表达量最高,在其他阶段的表达较为稳定。不同种类的病原物在不同浓度和诱导时间,对CM-CecA基因的诱导表达作用有所不同。对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的响应时间峰值都是在第12个小时,分别是40倍和41倍。在注射的大肠杆菌OD600值为0.3和2.0时,反应的强度较高;金黄葡萄球菌OD600值为0.5和1.0时,响应强度最高。而幼虫在经过不同的大肠杆菌和金黄葡萄球菌处理后4个小时,Hsp70的表达量并无显著上升,表明可能大肠杆菌、金黄葡萄球菌等刺激因子可能都对幼虫CM-CecA基因有诱导作用,对CM-Hsp70蛋白没有诱导作用。幼虫面对恶劣的环境时,免疫系统可能以进攻为主。当受到病原物侵染时,CM-CecA抗菌肽表达量剧增,加强幼虫的防御能力。由于热激蛋白的种类较多,而本文仅对其中一种进行了研究,难以真实反映病原物侵染对热激蛋白表达的诱导作用,尚待进一步研究。
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