谷子SiWRKY57对类胡萝卜素相关代谢途径的调控机制研究

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谷子[Setaria italica(L.)P.Beauv.]是中国北方重要的杂粮作物,富含膳食纤维、维生素及多种次生代谢物质等,被誉为“杂粮之首”。谷子籽粒富含类胡萝卜素,前期我们通过WGCNA鉴定到参与谷子籽粒类胡萝卜素代谢的关键调控因子SiWRKY57,但目前关于WRKY57基因功能的研究仅集中在抗旱及抗灰霉病上,而其对类胡萝卜素的调控作用研究较少。本研究针对谷子SiWRKY57基因功能展开深入研究,对SiWRKY57及类胡萝卜素下游代谢产物脱落酸(ABA)和独角金内酯(SLs)合成通路基因进行序列分析、系统进化分析、启动子分析;对谷子不同发育时期及不同组织中SiWRKY57进行表达特性分析;构建过表达载体转化拟南芥,根据表型、代谢物差异及表达分析,揭示其调控类胡萝卜素代谢的分子机制。具体研究结果如下:1.系统进化分析表明,谷子SiWRKY57与拟南芥At WRKY57为同源蛋白,两者可能具有类似的功能;序列特征分析表明SiWRKY57编码316个氨基酸,蛋白分子量为32.75 k Da,理论等电点为6.41,不稳定指数为70.96,属于酸性不稳定蛋白,具有亲水性,不属于跨膜蛋白和分泌蛋白;系统进化分析可知不同物种间WRKY57蛋白相对保守;2.通过序列检索,从谷子中鉴定到15个ABA合成基因及6个SLs合成基因;系统进化分析表明,谷子与其他5个物种间ABA及SLs合成基因蛋白序列相对保守;启动子分析表明,21个基因中有11个基因启动子上游含有WRKY结合位点W-box。3.q RT-PCR结果表明,SiWRKY57在抽穗期表达量高于苗期及拔节期;苗期SiWRKY57在鞘中表达量最低,而在半展开叶中表达量最高,是鞘中表达量的10.6倍;拔节期SiWRKY57在各个组织中表达量均比较低;抽穗期时SiWRKY57在茎中表达量最低,而在根中表达量最高,是茎中表达量的14.9倍;SiWRKY57在籽粒中表达量随着籽粒发育逐渐降低,S1时期是S5时期的3倍。4.构建SiWRKY57-m GFP过表达载体,并于烟草叶片瞬时表达,结果表明SiWRKY57蛋白质定位在细胞核中;将35S::SiWRKY57过表达载体转入拟南芥中,发现过表达株系中At DXS1、At Z-ISO、At CRTISO、At CYP97A3、At BCH2表达量上调,并且三个株系类胡萝卜素含量分别提高至野生型的1.3、1.2、1.9倍。5.抗旱性分析结果表明,与野生型相比,过表达株系抗旱性提高,干旱胁迫下,三个株系SOD活性分别达到野生型的1.6、1.4、1.4倍,而MDA含量仅为野生型的0.45、0.82、0.84倍,q RT-PCR结果表明,ABA相关基因At ZEP、At NCED2、At ABI5、At RD29A在干旱处理后分别上调了31.5-59.5、0.3-0.9、2.7-10.6、0.6-14.0倍。6.表型观察发现,三个过表达株系分枝数分别增加至野生型的2.6、2.7、3.0倍,对SLs含量测定发现三个过表达株系SLs含量分别降低至野生型的0.69、0.63、0.82倍,q RT-PCR结果表明,SLs合成关键基因At D27在三个株系中表达量分别显著降低至野生型的0.11、0.15、0.06倍。综上所述,本文发现拟南芥中过表达SiWRKY57可以提高类胡萝卜素含量,增加抗旱性,降低SLs含量,暗示SiWRKY57可能参与调控类胡萝卜素合成及代谢流向,本研究为遗传改良植物类胡萝卜素含量,增加植物耐旱性、改善植物株型提供了理论依据。
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