一.研究意义及目的 1.1研究意义： 随着人类社会的进步和经济的发展，人类生活质量不断提高，但全球暖化的效应也持续加剧，暴风雨、水灾、旱灾、热浪和飓风等天灾越趋频繁猛烈。众所周知，二氧化碳是第一大温室气体，甲烷是第二大温室气体，每吨甲烷造成全球暖化的威力远远超过二氧化碳。在诸多甲烷排放源中，反刍动物是甲烷的主要排放源之一，其甲烷排放量占世界甲烷排放总量的25%。自从畜牧业对温室气体的“贡献”引起全球关注以来，牛羊等牲畜就成为环保专家们重点“整治”对象。甲烷是在反刍动物瘤胃微生物在分解、发酵植物纤维的过程中产生的，以CO2+4 H2→CH4+2 H2O为甲烷的主要生成途径。因此抑制反刍动物“甲烷”排放对保护人类赖以生存的自然环境具有非常重要的研究意义。 共轭哑油酸（Conjugated Linoleic Acid，CLA）是具有共轭双键的哑油酸的一组构象和位置异构体，共轭亚麻酸（Conjugated linoleinic acid，CLnA）是具有共轭双键的亚麻酸的一组构象和位置异构体。反刍动物脂肪中发现的共轭亚油酸与共轭亚麻酸有两种来源：瘤胃微生物对亚油酸或亚麻酸的生物加氢作用和动物组织从trans11C18：1的生物合成。CLA在人类和动物中具有重要的功能，特别是cis9，trans11C18：2（cis9，trans11CLA）和trans10，cis12C18：2（trans10，cis12CLA）不仅具有抗癌和促生长作用，还具有降低体脂、增强免疫功能等生物学功能。近年对CLnA的研究表明，CLnA具有比CLA更理想的抗癌、促生长作用，和降低体脂、增强免疫功能等生物学特性。反刍动物源食品是人类通过天然食品摄入CLA和CLnA的唯一渠道。增加反刍动物源食品中共轭亚油酸和共轭亚麻酸的含量，从而改善动物产品质量对人类健康具有重要的研究意义。 1.2研究目的： 在以基础日粮添加共轭脂肪酸生成前体调控反刍动物瘤胃脂肪代谢的基础上，进行系列奶牛瘤胃微生物体外（in vitro）发酵试验和山羊体内（in vivo）代谢试验，利用瘤胃微生物种间对氧的竞争机理，改变瘤胃内代谢氧途径，进而影响亚油酸及亚麻酸的生物氧化机制，探讨调控反刍动物瘤胃微生物发酵作用下对共轭亚油酸、共轭亚麻酸及甲烷生成的途径和机理。本研究旨在最大限度提高瘤胃微生物合成共轭脂肪酸（CLA，CLnA）的生物学效率的同时，最大限度抑制代谢过程中甲烷的生成效率。 二.主要研究结果概述 2.1试验一.丙酸生成前体对体外瘤胃微生物发酵特性及甲烷生成的影响 在瘤胃内，碳水化合物的降解过程可分为两个阶段：首先是复杂的碳水化合物在各种酶的作用于下降解成简单的糖类，然后这些简单的糖类迅速被微生物利用转化成丙酮酸，丙酮酸再经过各种代谢途径进行发酵，终产物为丙酸等挥发性脂肪酸及甲烷等产物。瘤胃微生物生成丙酸（propionate）的途径主要有两种，在正常情况下，二羧酸途径（苹果酸（malate）-琥珀酸（succinate）生成途径）为丙酸生成主要途径。富马酸（fumarate）、苹果酸作为瘤胃微生物丙酸生成前体，可作为电子受体接受质子氢生成丙酸。研究证明富马酸和苹果酸作为控制甲烷的有效途径是转移合成甲烷的前体-氢，从而抑制反刍动物甲烷生成。本试验的主要目的是通过研究二羧酸途径中丙酸生成的主要前体-富马酸（Fumarate）和苹果酸（malate）不同作用水平及化学类型对体外瘤胃微生物发酵特性及甲烷的影响，为开展后续系列研究确定最佳作用水平及化学类型。 2.2试验二.丙酸生成前体对亚油酸（Linoleic acid）生物合成共轭亚油酸（CLA）及甲烷的影响 本试验旨在研究丙酸生成前体在瘤胃微生物作用下对亚油酸（Linoleic acid，C18：2）代谢生物合成共轭哑油酸（CLA）及其脂肪代谢过程中对甲烷生成的影响。 2.3试验三.丙酸生成前体对亚麻酸（Linolenic acid）生物合成共轭亚油酸（CLA），共轭亚麻酸（CLnA）及甲烷的影响 本试验旨在研究丙酸生成前体在瘤胃微生物作用下对亚麻酸（Linolenic acid，α-C18：3）代谢生物合成共轭亚油酸（CLA）及共轭亚麻酸（CLnA）及其调控脂肪代谢进程中对甲烷产量的影响。 2.4试验四，富马酸及多不饱和脂肪酸影响红花油脂肪酸代谢生成CLA及甲烷的机理研究 本试验旨在研究丙酸生成前体（富马酸）及多不饱和脂肪酸（C20：5，C22：6）在瘤胃微生物作用下对富含亚油酸（Linoleic acid，C18：2）的红花油（safflower oil）代谢机制及其调控脂肪酸代谢过程中对甲烷合成效率的影响。 2.5试验五.富马酸及多不饱和脂肪酸影响亚麻子油脂肪酸代谢生成CLA，CLnA及甲烷机理研究 本试验旨在研究丙酸生成前体（富马酸）及多不饱和脂肪酸（C20：5，C22：6）在瘤胃微生物作用下对富含亚麻酸（Linolenic acid，C18：3）的亚麻子油代谢机制及其调控脂肪酸代谢过程中对生成甲烷的影响。 2.6试验六.富含亚油酸的植物油对奶山羊瘤胃及乳脂中CLA含量及甲烷理论产量影响 本试验旨在研究反刍动物口粮中添加富含亚麻酸的植物油对奶山羊瘤胃及乳脂中CLA含量及甲烷理论产量的影响。选择4只体况良好体重为65kg+15的Saanne奶山羊，安装永久性瘤胃瘘管。以全价浓缩颗粒饲料（80%）与干黑麦草（20%）作为基础日粮；分别添加黄豆油（富含亚油酸的植物油），碳酸氢钠（瘤胃缓冲剂）和瘤胃素（莫能菌素，调控瘤胃发酵）。 三.研究结论： 3.1富马酸和苹果酸作为在“草酰乙酸-丙酸”途径中生成丙酸的主要前体，提高了丙酸生成量，有利于瘤胃微生物发酵。同时，在合成丙酸的代谢途径中，作为电子受体接受氨电子合成丙酸，降低了甲烷的产生。在本试验中，添加24mM的丙酸前体（钠盐或酸形式）效果比较理想。 3.2富马酸和苹果酸在作为电子受体利用氢电子合成丙酸的代谢途径中，影响了亚油酸及亚麻酸代谢中的生物氰化进程，使CLA及CLnA生成效率得到提高。同时由于在上述代谢过程中氢电子的转移，使甲烷生成菌利用二氧化碳和氢电子合成甲烷的效率被抑制。亚油酸及亚麻酸在其代谢过程中也抑制了甲烷的产生。 3.3富马酸和多不饱和脂肪酸不影响瘤胃微生物发酵。多不饱和脂肪酸富含多个不饱和双键，双键的氧化饱和作用影响了亚油酸的生物氢化作用，使CLA及CLnA生成效率提高，甲烷产量降低。富马酸和多不饱和脂肪酸的协同作用，加快了代谢氢转移，导致CLA及CLnA生成量达到最高，甲烷产量降至最低。 3.4反刍动物日粮中添加适量的富含亚油酸的植物油，可提高瘤胃与乳脂肪中CLA含量，降低甲烷理论产量。 四.本研究的创新点 4.1综合利用反刍动物瘤胃内碳水化合物及脂肪代谢途径，研究丙酸生成前体、脂肪代谢的生物氧化作用及甲烷生成过程中瘤胃微生物种间代谢氢竞争产生的效应。发现丙酸生成前体利用代谢氧提高丙酸含量，使氧电子转移降低甲烷生成效率，同时抑制脂肪酸生物氢化效率，使CLA和CLnA累积量提高；发现亚油酸和哑麻酸以及富含亚油酸或亚麻酸的植物油作用可抑制甲烷气体的产生。 4.2发现丙酸生成前体与多不饱和脂肪酸协同作用，可加快代谢氢的转移，最大限度提高功能性共轭脂肪酸生成效率，最大限度降低甲烷产量。为反刍动物提高功能性共轭脂肪酸含量及抑制甲烷产量的双重目的提供了重要理论价值。 4.3对功能性脂肪酸CLA和CLnA进行同时研究，发现CLnA的生物氢化速度比CLA较为缓慢。 4.4通过在奶山羊日粮中添加适量的富含亚油酸的植物油，发现瘤胃CLA生物合成量提高的同时，乳脂中CLA含量也得到相应提高。同时发现亚油酸的生物氢化使甲烷理论产量得到降低。 五.有待进一步研究的问题 5.1本试验开展的体外研究数据不能简单地应用到活体动物条件下，有必要以本研究为基础，开展进一步的活体动物代谢与饲养研究，获取必要的定量参数为实际生产提供重要的理论依据。 5.2多不饱和脂肪酸影响共轭脂肪酸生物氢化作用机制尚未明晰，有待于对其进行更深入的理论研究。 5.3日粮中添加适量的富含亚油酸的植物油可抑制甲烷理论产量，但在实际生产中日粮中添加脂肪对反刍动物的适应性及对甲烷实际生成量如何产生影响需开展进一步研究。 5.4丙酸生成前体如富马酸和苹果酸在实际生产中饲养成本较高，在获取一定的体内体外研究数据后，研究和开发富含此类成分的优质牧草对控制反刍动物甲烷排放效应具有较好的理论和社会意义。