CpG-ODN对HepG2细胞及其相关因子的作用研究

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目的研究未甲基化CpG寡核苷酸(CpG-ODN)对肝癌细胞HepG2的作用:一方面包括CpG-ODN通过具有TLR9阳性表达(TLR9~+)的人外周血单核细胞(PBMC)对HepG2的间接作用,另一方面包括CpG-ODN对TLR9~+ HepG2细胞的直接作用,以此对CpG-ODN在肿瘤免疫治疗中的安全性作出初步评价。方法主要包括三方面:1)提取含有CpG-ODN的质粒,用质粒CpG-ODN、多肽单独或联合刺激PBMC,之后与HepG2共孵育,分别提取两种细胞的总RNA,并进行反转录得到cDNA,设计合成MyD88、Caspase-8的PCR引物,以得到的cDNA为模版,β-actin为内参进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测MyD88、Caspase-8的表达情况;2)使用磷硫酰CpG-ODN刺激TLR9~+细胞,即PBMC和HepG2,提取总RNA进行反转录得到cDNA,设计合成抗凋亡因子Bcl-xL、Bcl-2,凋亡因子Bid以及TLR9的PCR引物,以β-actin为内参进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测Bcl-xL、Bid、Bcl-2、TLR9的表达情况;3)使用磷硫酰CpG-ODN刺激HepG2,流式细胞仪检测细胞周期。结果1、质粒CpG-ODN能诱导与HepG2共孵育后的PBMC高表达MyD88,间接影响HepG2中MyD88、Caspase-8的表达;2、CpG-ODN对PBMC中Bcl-xL、Bid表达有一定影响,对HepG2中Bcl-xL、Bcl-2、Bid表达的影响较明显,即当CpG-ODN的浓度在0~3μM范围内升高时,HepG2中抗凋亡基因Bcl-xL、Bcl-2的mRNA水平有降低趋势,凋亡因子Bid有增高趋势,抗凋亡因子与凋亡因子的比率减小;3、正常状态HepG2在0.5~2.5μM CpG-ODN作用下,细胞周期无明显变化;在2.5~25μM CpG-ODN作用下,HepG2细胞周期中的G1期增大,S+G2/M期减小;在25~50μM CpG-ODN作用下,G1期减小,S+G2/M期增大;4、生长状态不良的HepG2在CpG-ODN作用下,凋亡率APO明显增大,且呈剂量-效应依赖性。结论TLR信号通路中的关键接头分子——MyD88,该信号通路的激活可能是质粒CpG-ODN刺激PBMC杀伤肿瘤细胞的作用机制之一,此外PBMC杀伤HepG2的分子机制中可能涉及HepG2中Caspase-8的表达;CpG-ODN可能是通过调控Bcl-2家族成员表达而有诱导HepG2凋亡的趋势,这包括Bcl-xL、Bcl-2、Bid;在HepG2状态正常条件下,低浓度CpG-ODN(0.5~2.5μM)对HepG2细胞周期的作用不明显,中浓度CpG-ODN(2.5~25μM)对HepG2的增殖有一定的抑制作用,高浓度CpG-ODN(25~50μM)有促进HepG2增殖的趋势;在HepG2状态不良条件下,CpG-ODN可以促进HepG2细胞凋亡。
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