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本研究采用了基因克隆表达及蛋白纯化,Western-blot等分子生物学手段,希望通过该研究推进口服或饲喂疫苗来更有效并且方便的预防治疗病毒性肿瘤疾病。
首先,我设计一对引物,通过克隆扩增得到了鼠源白细胞介素4基因。将这段基因段克隆到pGEM-Teasy载体,经测序确定序列正确后,我分别将这段基因克隆到pGEX-KG和pET28a表达载体。在IPTG的诱导下,这两段基因分别在大肠杆菌DH5α和BL21中都得到了高效表达。表达产物的大小分别为42kDa、18.6kDa。纯化mIL4-GST融合蛋白免疫蛋鸡和兔子制备卵黄抗体和兔血清抗体。该抗体可与原核表达的mIL4-GST和mIL4-his融合蛋白发生特异性免疫反应。该抗体的获得为深入研究mIL4蛋白的功能提供了基础。
通过相同的分子生物学克隆表达技术成功的表达了鼠源白细胞介素4与雪花莲凝集素的融合蛋白(pET28a-mIL4GNA),融合蛋白大小约为27kDa。纯化该融合蛋白,然后该融合蛋白饲喂balb/c小鼠,每只一周饲喂一次,每次用量约400ug,共灌喂四次。最后取血,用Dot-blot检测血清中含有鼠源白细胞介素4。但是我们检测到鼠源白细胞介素4的抗体。同时解剖BALB/c小鼠检查,并没有有任何病理变化。
综上所述,初步鉴定雪花莲外源凝集素具有携带外源蛋白进入血液循环的功能。以后我们将通过其它手段表达有蛋白活性的融合蛋白(pET28a-mIL4GNA),通过其它实验方法进一步验证雪花莲外源凝集素的功能,深入探讨雪花莲外源凝集素的功能。