研究背景:许多细菌寄居在口腔内,而口腔也为各种微生物的定植提供了独特的栖息地。牙龈卟啉单胞菌为革兰阴性厌氧菌,是一种条件性致病菌,与牙周炎及种植体周围炎等口腔疾病的发生密切相关[1-3]。生物膜介导的感染是引起牙周炎和种植周炎的重要因素之一[4,5]。牙龈卟啉单胞菌可分泌特有的毒力因子[6,7],已有研究表明,存在于生物膜中的牙龈卟啉单胞菌是导致种植体周围炎的主要致病因素[8]。由于生物膜细胞外基质保护生物膜内的细菌免受抗菌素和宿主免疫系统的干扰,生物膜内的细菌对抗菌治疗更具有耐受性[9],因此,研发新的药物用来防止生物膜的形成和(或)破坏已建立的生物膜对种植体周围炎的预防及治疗是相当有意义的。D-氨基酸是细菌细胞壁肽聚糖的主要组成成分[10]。不同种类的细菌可以合成和释放D-氨基酸。释放的D-氨基酸具有调节细菌细胞壁化学结构和生物膜发育的功能。无论是单独应用D-氨基酸还是联合应用D-氨基酸均能有效触发细菌生物膜的分散,同时也能抑制细菌生物膜的形成。如D-氨基酸混合物能够有效抑制枯草杆菌生物膜的形成并可分散成熟的枯草杆菌生物膜[11];D-脯氨酸、D-酪氨酸以及D-苯丙氨酸均可抑制金黄色葡萄球菌生长及生物膜的形成,并且上述三种D-氨基酸联合应用可促使成熟的金黄色葡萄球菌生物膜分解[13]。关于D-氨基酸如何影响生物膜的作用机制目前尚未完全破解。有研究表明D-氨基酸可以通过抑制细菌黏附[14],降低胞外基质的含量[14],调节细菌细胞的能动性[15]、干扰蛋白质形成[16],重组细菌细胞壁[17],从而影响生物膜的形成。近年来,D-氨基酸与细菌生物膜之间的关系及应用D-氨基酸对抗细菌生物膜介导的感染已受到广大学者的关注,但目前对D-组氨酸是否能有效抑制牙龈卟啉单胞菌生物膜的形成,以及D-组氨酸是否可以促进成熟的牙龈卟啉单胞菌生物膜分散暂无报道。目的:本研究旨在研究D-组氨酸对牙龈卟啉单胞菌生物膜形成及分散的影响。研究结果可能为研发治疗牙周炎及种植体周围炎的药物提供一定的理论依据。方法:本实验在琼脂板中复苏及培养牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis ATCC 33277),而后将单菌落细菌接种至液体脑心浸液(BHI)培养基中进行增殖。通过绘制P.gingivalis生长曲线及MTT染色方法评估D-组氨酸对P.gingivalis活性的影响。通过结晶紫染色实验评估D-组氨酸对P.gingivalis生物膜生物量的影响。采用胞外多糖实验评估D-组氨酸对只gingivalis生物膜胞外多糖含量的影响;通过扫描电自显微镜(SEM)观察经D-组氨酸处理后P.gingivalis形态和生物膜的结构。采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察D-组氨酸是否具有杀伤P.gingivalis生物膜中细菌的作用。结果:1.D-组氨酸在浓度≥1%时,即可抑制P.gingivali的生长。2.D-组氨酸抑制P.gingivalis生物膜的形成。2.1 D-组氨酸浓度≥10%时,减少P.gingivalis生物膜生物量及胞外多糖的含量,且抑制作用呈浓度依赖性。2.2经扫描电子显微镜观察,D-组氨酸浓度在25%、50%、75%、100%时,随着D-组氨酸浓度的增加,细菌的聚集量也随之下降,细菌也没有彼此连接形成生物膜,可观察到外渗的细菌成分。2.3采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察经D-组氨酸处理的P.gingivalis,D-氨基酸浓度在50%。、75%、100%时,P.gingivalis的黏附量、聚集量下降,并且活菌的数量和死菌的数量都明显减少。D-氨基酸浓度为10%和25%时,活菌的数量较多,可形成较大的聚集体,但并没有连接成生物膜。3.具有生物膜抑制作用的D-组氨酸可促使成熟的牙龈卟啉单胞菌生物膜分解3.1浓度为25%、50%、75%、100%的D-组氨酸处理成熟的P.gingivalis生物膜,生物膜生物量和生物膜胞外多糖含量均呈浓度依赖性下降3.2 D-组氨酸浓度为25%、50%、75%、100%时,可以有效分散成熟的P.gingivalis生物膜,同时死亡的细菌数量也明显增加。结论:1.低浓度的D-组氨酸即可抑制P.gingivalis的生物活性,并呈浓度依赖性抑制浮游细菌的生长。2.D-组氨酸具有良好的抑制P.gingivalis生物膜形成的作用,并可促使成熟的P gingivalis生物膜分散。