芍药（Paeonia lactiflora Pall.）观赏价值高,可作为园林造景及鲜切花材料,而且还具有很高的药用价值。然而芍药种子独特的胚轴双重休眠特性会造成萌芽率低,严重影响了繁殖应用及杂交新品种的选育。研究表明,脱落酸（abscisic acid,ABA）是调控种子休眠萌发的重要植物激素。目前对于芍药种子胚轴双重休眠解除过程的认识,尤其在分子水平,尚不够系统,且ABA在这一过程发挥的具体作用尚未明确。本研究通过分析芍药种子休眠解除过程中的差异表达基因,并结合ABA含量的测定,筛选出编码ABA分解代谢关键酶的PlCYP707As基因,结合多种试验手段分析其在ABA分解途径及种子休眠解除中的功能,结果可丰富PlCYP707As调控种子休眠的相关理论,为进一步探索和阐明芍药种子胚轴双重休眠解除过程提供科学依据。主要的研究结果如下:1.将芍药种子休眠解除过程划分为三个阶段:种子吸胀,下胚轴休眠解除及上胚轴休眠解除。种子吸胀是芍药种子休眠解除的标志,下胚轴休眠解除是完成休眠解除的基础,上胚轴休眠解除过程最为复杂。种子休眠解除过程中共获得7139个差异表达基因,在种子吸胀过程中,共有1278个基因发生差异表达,其中582个基因上调表达,696个基因下调表达;在下胚轴休眠解除过程中,共有1809个基因发生差异表达,其中836个基因上调表达,973个基因下调表达;在上胚轴休眠解除过程中,差异表达基因最多,为3049个,其中有2203个基因上调表达,846个基因下调表达。2.植物激素调控种子休眠解除。在芍药种子休眠解除过程中,共有91个与植物激素代谢和信号转导相关的基因发生差异表达,共涉及8种主要植物激素,包括脱落酸、赤霉素、乙烯、生长素、细胞分裂素、油菜素内酯、茉莉酸和水杨酸。其中,脱落酸,生长素和乙烯代谢或者信号转导相关的差异表达的基因较多,另外五种植物激素代谢或者信号转导相关的差异表达的基因较少,这些基因可作为未来研究植物激素影响芍药种子休眠解除的重点候选基因。3.对芍药种子休眠解除过程及不同部位内源ABA含量进行测定表明,在芍药种子休眠解除的过程中,ABA含量基本呈现下降趋势,特别是在种子下胚轴休眠解除过程中下降最为显著。下胚轴休眠解除又是芍药种子休眠解除的必要环节,因此认为ABA含量下降是影响芍药种子休眠解除的主要因素。芍药成熟种子种皮中的ABA含量最高,约为胚和胚乳中ABA含量的10倍。而根据芍药种子结构特点,种胚与种皮不直接接触,因此胚和胚乳中ABA是影响芍药种子休眠的主要原因。4.以芍药愈伤组织为受体材料,初步研究了农杆菌介导的遗传转化条件。通过愈伤组织对抗生素的敏感性试验,确定了抗性愈伤筛选时抗生素Kan和Cef的浓度分别为125 mg·L^-1和300 mg·L^-1。通过转入GUS基因来统计转化率,研究菌液浓度、侵染时间和共培养天数这三个因素对愈伤组织遗传转化的影响,结果表明以愈伤组织为转化受体,最佳菌液浓度是OD600=0.6,最佳侵染时间为25 min,最佳共培养时间为3 d。5.课题组前期已获得PlCYP707A1和PlCYP707A2的CDS序列。本研究中继续克隆了PlCYP707A3的CDS序列,长度为1404 bp,编码467个氨基酸。经比对发现三者序列差异较大,蛋白保守域分析表明均含有细胞色素P450单加氧酶的结构域,与葡萄和月季亲缘关系较近,蛋白的亚细胞定位显示三者均定位于细胞质中和细胞膜上。三者在种子不同部位和休眠解除不同阶段呈现不同表达模式。在种子吸胀和下胚轴休眠解除过程中三者协同上调表达是影响ABA含量下降的重要原因。在上胚轴休眠解除过程中,PlCYP707A2发挥了一定作用。通过在芍药愈伤组织和拟南芥的转基因试验,证明了PlCYP707As对于ABA的分解及种子萌发都发挥了一定的作用。因此,PlCYP707As通过调节ABA含量,促进了芍药种子休眠的解除。综上所述,本研究系统划分了芍药种子的休眠解除阶段并对各阶段差异表达基因进行了分析。结合内源ABA含量测定,确定了PlCYP707As在种子休眠解除过程中发挥作用,通过多方面试验研究了PlCYP707As的功能,填补了芍药中在ABA分解基因方面研究的空白。基本实现了从基因差异表达,生理改变至表型变化的系统性研究,这对提高芍药种子胚轴双重休眠解除过程的认识有重要作用,为深入解析调控这一过程的分子机制奠定了重要基础。