植物油脂是植物体内三大营养物质之一,也是人类最重要的油脂来源。课题组前期研究了WRINKLED1(WRI1)对陆地棉(Gossypium hirsutum L.)种子油脂含量的影响,结果表明上调转录因子GhWRI1的表达使T0代陆地棉种子油脂含量降低,这与拟南芥WRI1报道的结果相反。为明确转录因子GhWRI1在陆地棉中的转录调控功能,GhWRI1不同结构域对核定位、转录激活及结合顺式作用元件的影响,本研究首先测定了陆地棉GhWRI1转基因T3代植株各组织的油脂及可溶性糖含量;其次,通过GhWRI1蛋白结构域的预测,利用5′端、3′端删除法及点突变法获得了含不同结构域的突变基因;此外,利用无缝克隆的方法构建了一系列表达载体,并通过烟草瞬时表达系统、酵母双杂交系统及双荧光素酶检测系统,分别评估了GhWRI1各个结构域对其功能的影响。主要结果如下:1、GhWRI1能够调控棉花叶片、胚珠及纤维中碳的再分配为鉴定GhWRI1在陆地棉中的功能,本研究利用Quantitative Real-Time PCR筛选了高表达GhWRI1基因的转基因植株,并测定了上调表达GhWRI1 T3代转基因陆地棉叶片、27 DPA胚珠、27 DPA纤维的油脂和可溶性糖含量。结果显示:与野生型相比,上调GhWRI1基因的表达使27 DPA胚珠及纤维中油脂的含量分别降低了4.93%~10.46%及19.95%~42.53%,可溶性总糖含量分别增加了10.44%~26.02%和31.21%~69.54%;在筛选获得的两个转基因株系叶片中,其油脂含量显著增加了22.45%和22.94%,而可溶性总糖含量降低了14.80%~22.24%。表明上调GhWRI1的表达能够对棉花叶片、胚珠以及纤维中的脂质代谢和糖代谢的碳流进行调控和再分配。2、GhWRI1结构域及核定位信号分析利用NCBI、NLStradamus及PSORT等在线工具对GhWRI1蛋白的氨基酸序列进行结构域及核定位信号的分析和预测。结果显示:GhWRI1蛋白共含有7个结构域和一个核定位信号。7个结构域包括TauE superfamily、Oxidored_q4 superfamily、67 superfamily、DUF3446 superfamily、上游AP2、下游AP2和EpsG superfamily,其中AP2结构域是各物种WRI1转录因子高度保守的结构域;核定位信号位于该蛋白氨基酸序列的N末端48~55位氨基酸残基(GhWRI148-55)处,氨基酸序列为“PKAKRARK”。3、GhWRI1的结构域对该蛋白进入细胞核具有一定的影响通过5′端及3′端删除法获得了GhWRI1删减突变基因,并分别构建了其N末端及C末端eGFP融合载体,利用烟草瞬时表达系统,检测了GhWRI1各个突变体的亚细胞定位。结果显示:GhWRI1氨基酸序列的N末端第48~76位氨基酸(GhWRI148-76)处含核定位信号,对该蛋白的入核功能具有重要作用;AP2、EpsG superfamily等7个结构域对其进入细胞核具有不同程度的影响,其中,EpsG superfamily结构域受损时进入细胞核的数量更多,即EpsG superfamily结构域会影响该蛋白的稳定性。4、GhWRI1的C末端55个氨基酸序列足以保证该蛋白的转录激活作用为研究GhWRI1蛋白结构域对其转录激活活性的影响,检测了一系列GhWRI1突变体蛋白的转录激活活性。结果显示:C末端307~362位氨基酸序列(GhWRI1307-362)缺失或单个AP2结构域缺失的GhWRI1突变体蛋白均没有转录激活活性。与此同时,含GhWRI1307-362序列的其他突变体蛋白存在不同强度的转录激活活性,即GhWRI1蛋白转录激活结构域位于其C末端第307~362位氨基酸处,大小为55个氨基酸;此外,N末端的7个结构域及核定位信号对GhWRI1转录激活功能有一定的影响。5、GhWRI1的第315/339位半胱氨酸(GhWRI1C315,GhWRI1C339)不是该蛋白转录激活作用的必要氨基酸利用NCBI在线工具检索获得了不同物种WRI1的同源序列,并利用MegAlign软件对同源序列的转录激活区进行聚类分析,发现在315位及339位氨基酸处分别含有一个同源性较高的半胱氨酸残基(GhWRI1C315,GhWRI1C339)。将两个半胱氨酸残基(C)进行丙氨酸残基(A)点突变后(GhWRI1C315A,Gh WRI1C339A),检测突变体的转录激活活性。结果表明:GhWRI1第307~362位氨基酸序列内所含的半胱氨酸不影响该蛋白的转录激活作用。因此,我们认为GhWRI1蛋白C末端的半胱氨酸残基(GhWRI1C315及GhWRI1C339)不是该蛋白转录激活所必须的氨基酸。6、两个AP2及EpsG superfamily结构域是GhWRI1识别靶标基因顺式作用元件的必须结构域为研究GhWRI1蛋白结构域对识别及结合顺式作用元件的影响,构建了一系列GhWRI1删减突变体基因的相关载体,经烟草叶片瞬时表达并利用双荧光素酶分析系统检测了蛋白结合的强度,结果显示:当两个AP2及EpsG superfamily结构域同时存在时,具有较高的LUC/Ren酶活比值,反之,该蛋白识别下游顺式作用元件的能力下降。因此,我们认为同时存在的两个AP2及EpsG superfamily结构域是GhWRI1识别并结合下游顺式作用元件的必要结构。