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药物难治性癫痫耐药机制中PGP和MRP1作用的研究研究背景：在过去的20年中，尽管不断有新的抗癫痫药(antiepileptic drugs，AEDs)投入临床应用，但仍有30％左右的癫痫患者对AEDs不敏感，出现难以被控制的反复发作，临床上称之为难治性癫痫。难治性癫痫的预后不佳，有较高的致残和致死率。因此研究难治性癫痫对AEDs产生耐药的原因，发现新的治疗措施，具有重要意义。在肿瘤化疗的过程中发现，长期接触某一种化疗药物产生的不仅对此种化疗药物耐药，而且可对其他结构和功能不同的多种化疗药物产生交叉耐药性的现象，此被称为多药耐药(multidrug resistance，MDR)。研究表明肿瘤细胞膜上表达的多药转运体，能够将化疗药物泵出细胞外，减少了肿瘤细胞内的药物浓度，参与了肿瘤耐药的发生。同样情况也出现在难治性癫痫上，通常如果患者对一种AED耐受，他往往也对其它的AEDs不敏感。研究发现难治性癫痫耐药和肿瘤耐药之间存在相同的病理机制。目前研究认为在生理条件下人体血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)毛细血管内皮细胞和胶质细胞上就有多药转运体的表达，而在难治性癫痫患者病灶切除的标本发现血脑屏障上有高表达的多药转运体。进一步对其功能的研究发现，多药转运体是一类ATP结合蛋白质超家族，能够识别多种作用机制不同的AEDs，主动将药物泵出到血脑屏障以外。因此认为，难治性癫痫患者脑内多药转运体表达增高，引起AEDs通过血脑屏障障碍，患者脑内AEDs浓度下降，可能参与了难治性癫痫多药耐药的发生。P-糖蛋白(P-glycoprotein，PGP)和多药耐药相关蛋白1(multi-drug resistance associated protein，MRP1)是被人们研究最早的两种多药转运体。本课题通过观察难治性癫痫患者和模型大鼠脑内PGP、MRP1的表达和分布；采用PGP、MRP1特异性拮抗剂维拉帕米(verapamil，Ver)和丙磺舒(probenecid，Pro)观察PGP和MRP1对苯妥英钠(phenytoin，PHT)和卡马西平(carbamazepine，CBZ)通过癫痫大鼠血脑屏障的影响；PGP对体外培养的耐药细胞内PHT和CBZ浓度的影响以及PGP对慢性杏仁核点燃模型大鼠电生理和行为的影响。在形态和功能不同角度研究PGP、MRP1在难治性癫痫多药耐药机制中的作用。材料与方法：本文共分四部分：第一部分建立慢性杏仁核点燃癫痫动物模型，采用RT-PCR、免疫组化和Western-blot的方法，观察难治性癫痫患者和模型大鼠脑内PGP、MRP1 mRNA和蛋白的表达。第二部分采用微透析技术和高效液相色谱技术，通过腹腔注射PHT和CBZ，观察在癫痫和正常大鼠皮层细胞外液AEDs的浓度差异；观察脑内局部给予PGP拮抗剂Ver和MRP1拮抗剂Pro后，癫痫大鼠皮层细胞外液中AEDs的浓度变化。第三部分建立PGP高表达的K562／Dox耐药细胞株，比较耐药细胞株和PGP表达阴性的K562细胞株对PHT和CBZ的摄取；观察给予Ver后，耐药细胞内AEDs的浓度变化。第四部分在杏仁核电点燃模型上，观察Ver对耐PHT和CBZ大鼠的后放电阈值(after discharge threshold，ADT)、后放电时程(after discharge duration，ADD)等电生理指标和行为学的影响。结果：第一部分实验结果：1．与对照组相比，难治性癫痫患者和大鼠脑内皮层和海马PGP mRNA和蛋白表达显著增高(P＜0.05)。2．与对照组相比，难治性癫痫大鼠脑内皮层和海马MRP1mRNA和蛋白表达显著增高(P＜0.05)；与对照组相比，难治性癫痫患者脑内皮层和海马MRP1mRNA表达显著增高(P＜0.01)；Western-biot和免疫组化结果显示难治性癫痫患者脑内皮层MRP1蛋白表达明显高于对照组(P＜0.01)；在对照组人类海马组织未见MRP1表达，难治性癫痫患者海马仅见少量星形胶质细胞表达MRP1。第二部分实验结果：1．与正常大鼠相比，癫痫大鼠在给药后30min-180min内各个时间点的皮层细胞外液PHT浓度明显降低(P＜0.05)；在给药后30min-150min各个时间点的皮层细胞外液CBZ浓度也明显降低(P＜0.05)。2．给予PGP拮抗剂Ver后增加了癫痫大鼠皮层细胞外液中PHT和CBZ的浓度，和对照组相比，PHT浓度在腹腔给药后15min-180min各个时间点都显著增高(P＜0.05)，CBZ浓度在给药后45min、60min和120min三个时间点显著增高(P＜0.05)。3．给予MRP1拮抗剂Pro后增加了癫痫大鼠皮层脑细胞外液中PHT和CBZ的药物浓度，和对照组相比，PHT浓度在腹腔给药后15min-180min各个时间点显著增高(P＜0.05)，CBZ浓度在给药后45min-120min各个时间点显著增高(P＜0.05)。第三部分试验结果：1．PHT和CBZ对K562／Dox细胞株(PGP高表达)的半数抑制浓度(IC50)明显高于K562细胞株(PGP表达阴性)；加入Ver后，PHT和CBZ对K562／Dox细胞的IC50明显下降，逆转倍数分别为2.5和1.5。2．K562／Dox细胞内PHT和CBZ的浓度均显著少于其药敏K562细胞，仅分别为正常K562细胞的23.6％和32.2％。当加入Ver后，K562／Dox细胞内AEDs浓度明显升高(P＜0.05)。第四部分试验结果：1．耐药组大鼠在给予Ver后，ADT明显高于对照组(P＜0.05)。2．相对于对照组，耐药组大鼠在给予Ver后，ADD时程明显缩短，Racine行为分级明显下降(P＜0.05)。结论：1．慢性杏仁核电点燃癫痫模型大鼠脑内皮层和海马存在多药转运体PGP和MRP1的表达升高；难治性癫痫患者脑内皮层和海马存在多药转运体PGP和MRP1的表达升高。2．PGP和MRP1具有限制PHT和CBZ通过血脑屏障的作用，引起癫痫大鼠大脑皮层细胞外液中AEDs浓度下降，参与了难治性癫痫的耐药机制。3．PGP和MRP1的拮抗剂Ver和Pro可以提高脑内细胞外液和细胞内AEDs的浓度，同时Ver可以协助AEDs改善耐药大鼠的电生理活动，降低点燃后发作分级，提示有效抑制PGP和MRP1作用，有助于改善多药转运体高表达导致的癫痫耐药。