背景：移植物抗宿主病(GVHD)是异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后的主要并发症和死亡原因,包括急性GVHD (aGVHD)和慢性GVHD(cGVHD)两大类。在人类白细胞抗原(HLA)相合的亲缘allo-HSCT中,aGVHD的发生率为30%～60%,在HLA相合的非亲缘和HLA不完全相合的allo-HSCT中,aGVHD的发生率达40%-90%。目前短程甲氨蝶呤(MTX)联合环孢菌素A (CSA)是临床最常用的aGVHD预防方案,但是仍然有不少患者合并重度和难治性aGVHD,导致移植失败。T淋巴细胞去除是预防aGVHD的有效方法,随之而来的植入失败和白血病复发使其在临床上难以广泛开展。一些新的方案如应用新的免疫抑制剂、单克隆抗体等可在一定程度上减少aGVHD的发生率,但移植物抗白血病(GVL)效应减弱,白血病复发率、移植后感染发生率增高,总体生存未见明显改善。cGVHD可严重影响患者各脏器功能和生活质量,是allo-HSCT后的主要远期并发症和死亡原因。Anasetti C等报道外周血造血干细胞移植后2年cGVHD的发生率为53%,骨髓移植后2年cGVHD的发生率为41%。治疗上目前尚无统一的防治方案。肾上腺皮质激素是治疗cGVHD的一线药物,对于肾上腺皮质激素难治性cGVHD,新型免疫抑制剂、靶向效应免疫细胞或炎性细胞因子的各种生物药物、调节性T细胞、间充质干细胞等可能在以后的治疗中发挥重要作用。调节性γδT细胞(γδTreg)于2009年9月在Journal of Immunology杂志上首次报道。该细胞是一群具有免疫抑制功能的新细胞亚群,它们与CD4+Treg细胞一样表达Foxp3转录因子,体外研究发现该细胞亚群具有与CD4+Treg细胞相似的生物学特性,最主要的功能是通过细胞与细胞间直接接触方式抑制经抗CD3和抗CD28单克隆抗体刺激增殖活化的外周血淋巴细胞；同时也分泌TGF-β1、IL-10等抑制性细胞因子。Li等最新研究发现γδTreg细胞在系统性红斑狼疮患者中的比例明显下降,进一步证实了该细胞具有负向免疫调控作用的生物学特性。而且该类细胞可特异性结合磷酸抗原类化合物如异戊烯焦磷酸(IPP)、唑来膦酸等,同时联合IL-2、IL-15和TGF-β1等细胞因子,可在体外扩增并富集,为进一步体内外研究γδTreg细胞的生物学特性提供了可靠的保障。目前报道的γδTreg细胞与一般Treg细胞具有相似的生物学特性,那么γδTreg细胞是否具有负向调控allo-HSCT后GVHD的生物学特性?在本研究中我们对γδTreg细胞的体外诱导扩增富集体系进行了进一步优化,对优化的机制进行了深入研究；接着对体外诱导扩增的y8Treg细胞在体外和小鼠体内的生物学特性和对GVHD的调控作用及其相关机制进行了研究；最后在临床异基因造血干细胞移植后患者外周血中γδTreg数量与GVHD相关性进行了深入的探讨。我们的研究进一步明确了γδTreg细胞的生物学特性,为临床上建立GVHD防治的新方案提供理论和实验依据；同时,也能为将来应用于实体器官移植排斥反应和自身免疫性疾病的治疗奠定实验基础。具体研究分为3部分：1) γδTreg细胞体外诱导培养体系的建立；2) γδTreg细胞在体外和动物模型移植物抗宿主病中的调控作用及其机制；3) γδTreg细胞在临床异基因造血干细胞后移植物抗宿主病中的调控作用。第一章调节性γδT细胞体外诱导培养体系的建立目的：γδTreg细胞是近来发现的具有免疫抑制功能的新细胞亚群,本部分的目的是建立一种高效的γδTreg细胞体外诱导培养体系,为进一步明确γδTreg细胞的生物学特性提供研究平台。方法：从健康成年人外周血中分离单个核细胞(PBMCs),加用IL-2、IL-15、TGF-β1和唑来膦酸(ZOL)进行诱导培养,第2天部分细胞加用地西他滨(0-2μmol/ml),第10天应用流式细胞术(FACS)检测γδTreg细胞含量,FACS和免疫磁珠分选技术(MACS)富集γδTreg;接着采用Western blot.分子克隆、转录因子活性芯片、DNA甲基化测序和启动子/增强子双荧光素酶报告系统等技术研究地西他滨诱导γδTreg细胞生成的分子机制。结果：经过10天培养后单用细胞因子诱导组生成36.2±5.7%的γδTreg (common γδTreg),细胞因子联合0.5μg/ml地西他滨组生成59.9±7.8%的γδTregs (DEC-induced γδTreg)。两组γδTregs细胞中Foxp3的平均荧光强度分别为52.6±8.9和182±9.9(p<0.05)；地西他滨作用后yδδT细胞中NF-κB表达上调和Foxp3基因上游增强子(-5031至-4792)和CNS3(3824-3938)区域去甲基化引起的增强子活性增加在诱导γδTreg生成中起关键作用。结论：本研究首次报道了地西他滨0.5μmol/l, IL-226.0U/ml, IL-1550ng/ml和TGF-β18.5ng/ml能高效诱导y8Treg细胞的生成,建立了高效的γδTreg细胞体外诱导培养体系。地西他滨通过上调NF-κB表达和Foxp3基因上游增强子和CNS3区域去甲基化引起的增强子活性增加进而诱导γδTreg细胞的生成。本章建立的诱导培养体系已获国家发明专利授权；且部分研究结果已发表于国际著名杂志Leukemia上。第二章γδTreg细胞在体外和动物模型移植物抗宿主病中的调控作用及其机制目的：在第一章中我们加用地西他滨建立了高效的γδTreg细胞诱导培养体系,本章的目的是明确本体系诱导培养的γδTreg细胞在体外和动物模型GVHD中的调控作用以及进一步阐明相应的分子机制。方法：采用CFSE标记的淋巴细胞增殖实验比较加用和不加用地西他滨诱导的γδTreg细胞(分别称为DEC-induced γδTregs和Common γδTregs)抑制经抗CD3和抗CD28刺激的T淋巴细胞的增殖能力,反应上清液中采用ELISA和Flowcytomix方法检测TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-10和TGF-β1水平,流式细胞术检测y8Tregs细胞表面标记,最后在经环磷酰胺(CTX)和抗CD122预处理的NOD/SCID小鼠体内输注经植物血凝素(PHA)活化的人PBMCs建立异种GVHD模型,在该模型基础上进一步比较加用和不加用地西他滨诱导的y8Treg过继免疫输注对小鼠异种GVHD的调控作用。结果：1)在淋巴细胞增殖实验中发现common γδTregs和DEC-induced γδTregs均能抑制PBMCs的增殖,但是DEC-induced γδTregs抑制PBMCs增殖的作用更明显,而γδT细胞并无抑制PBMCs增殖的能力；2)DEC-induced γδTregs与common γδTregs相比在体外更具稳定性；3)HLA-DR和可诱导共刺激分子(ICOS)在DEC-induced γδTregs中的表达水平明显上调；4) DEC-induced γδTregs比common γδTregs分泌更多地抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1;5)两种γδTreg细胞在NOD/SCID小鼠异种GVHD模型中具有保护作用,而DEC-induced γδTreg对GVHD的免疫保护作用比common γδTregs更强,common γδTregs细胞组和DEC-induced γδTreg细胞组小鼠的平均生存时间分别为32.0±2.2和45.5±4.3天(P<0.01)。结论：我们首次发现DEC-induced γδTreg比common γδTreg具有更强的负向免疫调控功能包括负向调控GVHD,更稳定的细胞免疫表型、更好的细胞活化状态、增强的Foxp3表达水平以及增高的抑制性细胞因子分泌水平等是该细胞免疫调控功能增强的主要机制。本章中我们建立的NOD/SCID小鼠异种GVHD模型已申请国家发明专利,且部分内容已发表于国际著名杂志Leukemia和Annals of Hematology。第三章γδTreg细胞在临床异基因造血干细胞后移植物抗宿主病中的调控作用目的：为了进一步明确γδTreg细胞在临床allo-HSCT后aGVHD和cGVHD中的调控作用。方法：选取2000年1月至2012年12月在浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心接受allo-HSCT治疗的患者,其中,aGVHD研究对象为2012年6月至12月在浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心接受allo-HSCT的患者,患者于造血干细胞回输后每周一次抽取外周静脉血样本,共4周,接着每月一次抽取外周静脉血,共2月。cGVHD研究对象为allo-HSCT术后1年及以上门诊随访者,包括无cGVHD随访者和合并cGVHD者,抽取患者肝素抗凝外周血10ml,采用FACS对外周血中γδTreg细胞占γδT细胞百分含量、CD4/CD8比例进行检测,并结合临床GVHD资料进行统计分析,同时我们收集了10名健康志愿者外周血作为正常对照。结果：在aGVHD研究中,共收集39例allo-HSCT后三个月患者外周血,其中21例发生aGVHD,我们发现allo-HSCT术后前3月y8Treg细胞含量很低,考虑y8Treg细胞尚未免疫重建,不参与aGVHD的调控。在cGVHD研究中,共收集41例患者,其中,15例为无cGVHD患者,26例为合并cGVHD患者,我们发现健康志愿者和cGVHD患者两组中的γδTreg细胞含量不具有统计学差异,但合并cGVHD患者中的γδTreg细胞含量比在健康志愿者中有增高趋势；而cGVHD患者和无cGVHD患者两组中的γδTreg细胞含量具有统计学差异(P=0.044),allo-HSCT后无cGVHD患者中的γδTreg细胞明显增高,进一步研究发现,cGVHD患者CD4/CD8比例明显偏低,该类患者外周血γδTreg细胞含量与CD4/CD8比例呈正相关性。结论：我们首次在临床allo-HSCT术后患者中发现γδTreg细胞通过改变CD4/CD8比例负向调控临床allo-HSCT术后cGVHD。