手性醇作为一种重要的手性砌块,被广泛运用于手性药物、农药物和精细化学品的合成当中。与传统化学方法制备手性醇相比,生物催化不对称还原法反应条件温和、立体选择性高和转化率高,因此成为合成手性醇的有效途径。(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(R)-CHBE]是一种非常有价值的手性中间体,被广泛应用于L-肉毒碱、阿法替尼和大环内酯A等手性药物的合成当中。因此,本研究的主要内容为从课题组筛选到的Lactobacilluscurieae S1L19(雷氏乳杆菌)中挖掘新型的醇脱氢酶基因,并将其应用于(R)-CHBE的不对称合成中,最终成功建立了(R)-CHBE的高效酶法制备工艺。具体研究内容如下:1.从Lactobacilluscurieae S1L19中挖掘得到了五种假定醇脱氢酶基因(LCRI、LCRⅡ、LCRⅢ、LCRⅣV和LCRV),并成功对其进行了克隆及目的蛋白的可溶性表达。通过多序列比对分析发现,LCRⅡ和LCRⅢ属于短链脱氢酶家族,LCRI,LCRⅣV和LCRV与奎宁氧化还原酶家族高度相似,属于中链脱氢酶家族。五种醇脱氢酶均对底物4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)显示出了催化活力,其中LCRⅢ显示出了最高的催化活力以及立体选择性(R构型,ee>99%)。因此选定醇脱氢酶LCRⅢ作进一步的研究。2.LCRⅢ的酶学性质研究。结果显示:LCRⅢ的最适pH为6.0,于中性偏酸的环境中较稳定;最适温度为35℃,在30℃和40℃的时候较稳定;金属离子Li+对酶有较高的激活作用,在7 mM的Li+存在时相对酶活为218%;LCRⅢ具有广泛的底物谱,对αα-、β-酮酯类以及芳香酮类等均显示出了催化活性。其中LCRⅢ对丙酮酸甲酯的催化活性最高,为284.2 U/mg;动力学分析发现LCRⅢ对COBE有较高的亲和力以及催化活力,Km 值为 4.28mM,Vmax 为 10.8U/mg。3.辅酶再生循环共表达系统的构建。昂贵的辅酶价格是阻碍醇脱氢酶工业化应用的重要限制性因素,为了降低反应成本,本研究将醇脱氢酶LCRⅢ与来源于枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)同时构建到质粒pET-28a(+)上,并实现了两种酶在大肠杆菌中的异源共表达。通过分析发现,共表达菌株中两种酶均表现出了较高的催化活力。LCRⅢ和BsGDH的干菌体活力分别为113.46 U/g和454.2 U/g。与双菌催化反应相比,共表达反应系统有更高的传质速率。4.不对称催化还原工艺的建立。为了建立一种经济可行、高效催化合成(R)-CHBE的方案,分别对反应参数:底物浓度(0.5-1.5M)、辅酶用量(0-0.5 mM)、催化剂用量(30-50 g/L)和金属离子用量(0-0.7 mM)进行优化。实验结果表明,在单水相体系中,最优反应条件(0 mM辅酶、0.7 mM Li+和40 g/L干菌)下,1.5 M(246.8 g/L)的COBE在6 h内能够完全转化,时空产率达到980 g/L/d。整个反应实现了无辅酶添加下的高浓度底物的完全转化,降低了反应成本,展现出了极高的工业化应用潜质。