前言：　　随着早产儿发生率的不断增加和存活率的显著提高，早产儿脑损伤问题倍受关注。病理学及流行病学研究证实的早产儿脑损伤主要为脑白质损伤。脑室周围白质软化(periventricular leukomalacia，PVL)是早产儿脑损伤的常见类型，与脑性瘫痪等密切相关，是存活新生儿出现神经发育和行为障碍的主要原因之一。缺氧缺血在早产儿脑损伤发病机制学说中占主导地位。PVL主要起源于缺氧缺血所致的侧脑室旁分水岭区脑白质的损害;少突胶质细胞前体细胞是PVL病变的主要靶细胞。缺氧缺血性损伤可导致晚期少突胶质细胞前体细胞凋亡，损害髓鞘形成进程，导致弥漫的髓鞘形成紊乱;促成了星形胶质细胞反应性活化增殖，发展为胶质斑痕。近年来对PVL患儿髓鞘形成障碍的机制提出了新观点:PVL髓鞘形成障碍的可能机制与“少突胶质细胞前体细胞向成熟少突胶质细胞发育障碍”有关。新近研究表明:星形胶质细胞过度活化增殖以至胶质斑痕形成，影响了少突胶质前体细胞的细胞周期时间，抑制其正常成熟，导致髓鞘形成受阻。胶质疤痕成为生理障碍阻断生长因子传递，抑制髓鞘再生。星形胶质细胞活化增殖可能是抑制哺乳动物中枢神经系统再生最重要的因素。有目的的调控缺氧缺血性脑损伤后星形胶质细胞的活性，有效扼制其过度增殖带来的负面影响，对早产儿脑损伤的治疗将具有重要意义。　　白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)是一种多功能的细胞因子，因其能抑制髓样白血病细胞系的生长和促进其分化而得名。已在多种细胞中发现有LIF的表达，LIF受体在中枢神经系统分布比较广泛。近年研究认为，LIF在中枢神经系统损伤病变中更多显示的是神经保护作用，被认为是一种神经营养因子。LIF具有促进少突胶质细胞存活和髓鞘形成以及抑制神经元凋亡的功能，LIF是胚胎期星形胶质细胞从神经前体细胞发育成熟的重要因子。鉴于LIF与少突胶质细胞、神经元以及星形胶质细胞关系密切，明确LIF是否参与了早产儿脑损伤病变的损伤或修复过程，将有助于早产儿脑损伤的研究。目前LIF与新生期脑损伤的研究报道少见，尚不清楚LIF是否以及如何影响早产儿脑损伤后星形胶质细胞增殖。　　与生后7日龄大鼠不同，生后2～5日龄新生大鼠少突胶质细胞发育处于晚期少突胶质前体细胞阶段;生后3日龄新生大鼠单侧颈总动脉结扎联合低氧模型能够产生PVL病变，是目前国际上公认的模拟早产儿脑损伤的动物模型。因此本研究通过建立PVL新生大鼠动物模型，研究PVL新生大鼠脑组织内源性LIF的表达变化，通过体内外实验进一步研究外源性LIF对PVL新生大鼠星形胶质细胞增殖的作用，并探讨其可能的机制。为早产儿脑损伤的治疗，提供理论依据。　　材料和方法：　　一、动物模型与分组　　健康清洁级3日龄(P3) Wistar大鼠，应用随机数字表法随机分为三组:对照组（SHAM组），实施假手术;实验组（PVL组），实施左侧颈总动脉结扎术联合低氧;LIF干预组（PVL+LIF组）:在左侧颈总动脉结扎联合低氧术后1天腹腔注射LIF（10μg/Kg·d，连续注射7天）。实施LIF干预时，与其对照的SHAM组和PVL组分别腹腔注射同等容积的无菌生理盐水。　　二、细胞模型与分组　　将同批次培养传至第三代的星形胶质细胞随机分为正常培养组(N)和氧糖剥夺培养组(OGD);两组按LIF终浓度的不同，再分别随机分为5个不同的干预组:LIF0ng/ml组（无LIF干预组）、LIF5ng/ml组、LIF10ng/ml组、LIF30ng/ml组、LIF50ng/ml组，分别正常培养和OGD培养6小时。　　三、标本的采集和处理　　（一）动物标本　　SHAM组和PVL组大鼠分别于缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28 d相应时间点处死，每组16只。LIF干预组及与其对照的SHAM组和PVL组于缺氧缺血后14d处死，每组8只。处死前乙醚吸入麻醉，局部消毒，依次打开腹腔、横膈、胸腔，暴露心脏，经左心室以生理盐水灌注至流出液体清亮，（用于制作石蜡或冰冻切片的标本继续以4％多聚甲醛灌注），断头取脑。待做病理形态学检测和免疫组化的标本置4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋;待做Real-time PCR和Western blot的标本包入无菌锡纸中置液氮罐内，冉转移至-80℃冰箱。　　（二）细胞标本　　弃培养基，PBS冲洗细胞后，用于免疫组化和免疫荧光的标本以4％多聚甲醛固定;待做Real-time PCR的标本用Trizol总RNA提取液裂解后，收集于DEPC处理的无菌Eppendorf管内，移至-80℃冰箱;待做Western blot的标本用0.25％胰酶消化后离心去上清，收集沉淀于无菌Eppendorf管内，移至-80℃冰箱冻存。　　四、实验方法及检测指标　　1、新生大鼠脑组织HE染色检测病理形态学改变;　　2、免疫组化法检测新生大鼠脑组织中GFAP和MBP蛋白的表达以及体外培养的星形胶质细胞PCNA蛋白表达;　　3、免疫荧光双标染色法检测新生大鼠脑组织中LIF和GFAP蛋白的共表达;　　4、CCK-8法测定体外培养的星形胶质细胞活力;　　5、EdU检测体外培养的星形胶质细胞DNA合成;　　6、Real-time PCR检测新生大鼠脑组织中LIF mRNA的相对表达量;Real-time PCR检测体外培养的星形胶质细胞PCNA mRNA、VEGF mRNA、miR20b-5p的相对表达量;　　7、Western blot测定新生大鼠脑组织中LIF、GFAP和MBP蛋白表达;Westernblot测定体外培养的星形胶质细胞PCNA、VEGF的蛋白表达;　　8、应用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent对体外培养的星形胶质细胞转染siR-RiboTM Transfection Control(Cy3)和miR-RiboTM miRNA inhibitor negative control和miR-RiboTMmiR20b-5p inhibitor。　　五、统计学分析　　所有数据采用SPSS16.0软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，各组内比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，进行正态分布及方差齐性检验，P＜0.05有统计学意义。　　结果：　　（一）体内实验　　1、新生大鼠脑组织HE染色检测病理形态学改变　　缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28d各组大鼠脑组织HE染色结果显示:HI后3d左侧（结扎侧）侧脑室周围白质区开始出现筛网状坏死灶，HI后7d开始出现左侧侧脑室扩大表现。HI后14d实验组大鼠病变程度明显加重，左侧侧脑室较对侧及对照组明显扩大，左侧脑白质组织结构稀疏模糊，脑室旁细胞排列紊乱，神经纤维走向紊乱，侧脑室周围可见囊性疏松坏死区域形成。HI后28d，实验组大鼠病变与HI后14d相似，病变程度未见明显加重。　　2、缺氧缺血后新生大鼠脑白质变化　　采用GFAP和MBP免疫组织化学染色方法对缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28d各组大鼠脑白质变化进行观察。GFAP染色结果显示:HI后3d实验组左侧（结扎侧）侧脑室周围白质区GFAP染色阳性细胞数开始较对照组明显增多，14d时达高峰;28d时较前有所下降，但仍明显高于对照组。免疫组织化学图像分析结果显示:除HI后1d外，其余各时间点实验组GFAP的平均光密度值高于相应对照组(P＜0.01);实验组各时间点比较，HI后14d组GFAP的平均光密度值最高，有统计学差异(P＜0.05)。　　MBP染色结果显示:HI后1d和3d时，实验组和对照组大鼠脑室周围白质区均未见MBP阳性染色。HI后7d时，对照组大鼠外囊、内囊和胼胝体等部位MBP免疫染色阳性;实验组结扎侧上述部位MBP阳性染色弱于对照组（P＜0.05）。HI后14d时，对照组大鼠脑室周围白质区MBP表达丰富，与HI后7d的对照组比较，MBP阳性染色明显增强;实验组结扎侧相应部位MBP阳性染色较对照组明显减弱（P＜0.01）。HI后28d时，实验组和对照组大鼠上述部位MBP阳性染色均较14d时有所增强，但实验组仍明显弱于对照组(P＜0.01)。　　3、缺氧缺血后新生大鼠脑组织LIF mRNA表达的时程变化　　实验组结扎侧脑组织LIF mRNA于HI后1d时表达增加，3d时达高峰，7d时表达下降，但仍高于对照组;HI后7d内，实验组LIFmRNA表达呈先升高后降低的趋势，与相应时间点对照组比较，有统计学差异（P＜0.01）。HI后14d时实验组LIF mRNA降至正常对照组水平，HI后28d实验组LIF mRNA低水平表达。实验组各时间点比较，HI后3d LIF mRNA表达升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　4、缺氧缺血后新生大鼠脑组织LIF蛋白表达的时程变化　　Western blot测定缺氧缺血损伤后不同时间点LIF蛋白的表达变化。实验组结扎侧脑组织LIF蛋白表达呈先升高后降低的趋势;HI后1d时表达升高，3d时达高峰，7d时表达较前下降，HI后14天时降至正常对照组水平，HI后28d时维持低水平表达。HI后7d内实验组与相应时间点对照组比较，LIF蛋白表达量有统计学差异(P＜0.01); PVL组内，HI后3d LIF蛋白表达量高于其他各时间点，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　5、缺氧缺血后新生大鼠脑组织LIF与GFAP免疫荧光双标染色　　取HI后3天实验组大鼠，进行LIF与GFAP免疫荧光双标染色。双标结果显示LIF与GFAP存在共表达，GFAP标记的星形胶质细胞表达LIF蛋白。　　6、外源性LIF对PVL新生大鼠脑组织GFAP和MBP蛋白表达的影响　　本研究应用小剂量LIF（10μg/Kg，连续7天腹腔注射）干预PVL新生大鼠，动态监测新生大鼠缺氧缺血后2周内体重变化，结果显示LIF的应用对新生大鼠体重无影响。LIF注射结束后7天（HI后14d），LIF干预组新生大鼠脑组织GFAP蛋白水平与PVL组比较有轻微下降趋势（下降8％）（P＜0.05）;LIF干预组新生大鼠脑组织MBP蛋白表达水平与PVL组比较无差异。　　（二）体外实验　　1、原代大鼠星形胶质细胞的培养及鉴定　　GFAP免疫细胞化学染色证实为星形胶质细胞，阳性率达95％以上。　　2、不同浓度LIF干预后星形胶质细胞活力变化　　相同浓度LIF干预的正常培养(N)组和氧糖剥夺(OGD)培养组比较，OGD组细胞活力增强，差异有统计学意义（P＜0.01）;但正常培养组内不同浓度LIF作用后细胞活力无明显变化，差异无统计学意义。OGD组内比较，LIF10ng/ml组细胞活力降低（P＜0.05）。　　3、不同浓度LIF干预后星形胶质细胞EdU阳性率的变化　　正常培养组内比较，LIF10ng/ml组与无LIF干预组星形胶质细胞EdU阳性率无差异。OGD组与相同浓度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培养组比较，EdU阳性率显著提高(P＜0.01)。OGD组内比较，LIF10 ng/ml组EdU阳性率降低(P＜0.05)。　　4、不同浓度LIF干预后星形胶质细胞PCNA mRNA表达变化　　正常培养组内比较，LIF10ng/ml组与无LIF干预组星形胶质细胞PCNAmRNA的表达无统计学差异。OGD组与相同浓度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培养组比较，PCNA mRNA的表达上调(P＜0.01)。OGD组内，LIF10 ng/ml组PCNA mRNA表达下调（P＜0.05）。　　5、不同浓度LIF干预后星形胶质细胞PCNA蛋白表达变化　　通过免疫细胞化学染色和Western blot检测了不同浓度LIF干预后PCNA蛋白表达变化，结果显示:正常培养组内，LIF10ng/ml组与无LIF干预组星形胶质细胞PCNA蛋白的表达无统计学差异（P＞0.05）;OGD组与相同浓度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培养组比较，PCNA蛋白的表达上调，差异有统计学意义(P＜0.01)。OGD组内，LIF10ng/ml组PCNA蛋白表达下调，有统计学差异(P＜0.05)。　　6、LIF干预后星形胶质细胞VEGF mRNA的表达变化　　LIF10ng/ml对正常培养组星形胶质细胞的VEGF mRNA的表达无影响。无LIF干预的OGD组与无LIF干预的正常培养组比较，VEGF mRNA表达显著上调(P＜0.01); OGD组内，LIF10ng/ml组与无LIF干预组比较，VEGF mRNA表达显著下调(P＜0.05)。　　7、LIF干预后星形胶质细胞VEGF蛋白的表达变化　　LIF10ng/ml对正常培养组星形胶质细胞的VEGF蛋白表达无影响。无LIF干预的OGD组与无LIF干预的正常培养组比较，VEGF蛋白表达显著增加(P＜0.01);OGD组内，LIF10ng/ml组与无LIF干预组比较，VEGF蛋白表达减少(P＜0.05)。　　8、LIF干预后星形胶质细胞miR20b-5p的表达变化　　LIF10ng/ml对正常培养组星形胶质细胞miR20b-5p的表达无影响。无LIF干预的OGD组与无LIF干预的正常培养组比较，miR20b-5p的表达显著下调(P＜0.05);OGD组内，LIF10ng/ml组与无LIF干预组比较，miR20b-5p的表达上调(P＜0.05);miR20b-5p的变化趋势与VEGF mRNA及蛋白的变化趋势相对应（负相关）。　　9、miR20b-5p抑制剂转染后实验结果　　(1)星形胶质细胞转染效率　　通过Lipo2000转染Cy3标记的siRNA荧光对照，分别以50nM、100nM的浓度进行转染，结果显示100nM浓度的转染效率明显高于50nM组。　　(2) miR20b-5p抑制剂转染后星形胶质细胞VEGF蛋白的表达变化　　正常培养条件下:转染miR20b-5p抑制剂对VEGF蛋白的表达无影响。　　氧糖剥夺培养条件下:①不论有无LIF干预，转染miR20b-5p抑制剂组与转染阴性对照组比较，VEGF蛋白表达均增加(P＜0.05)，但LIF干预后VEGF蛋白增加的程度(23％)大于无LIF干预的条件下(12％);②不论转染miR20b-5p抑制剂亦或是转染阴性对照，LIF(10ng/ml)干预组与无LIF干预组比较，VEGF蛋白表达均减少(P＜0.05)，但转染miR20b-5p抑制剂后VEGF蛋白减少的程度(13％)小于转染阴性对照条件下(21％)。　　(3) miR20b-5p抑制剂转染后星形胶质细胞增殖变化（EdU阳性细胞率）　　正常培养条件下:转染miR20b-5p抑制剂对EdU阳性细胞率无显著影响。　　氧糖剥夺培养条件下:①不论有无LIF干预，转染miR20b-5p抑制剂组与转染阴性对照组比较，EdU阳性细胞率均升高(P＜0.05)，但LIF干预后EdU阳性细胞率升高的程度(53％)大于无LIF干预的条件下(33％);②不论转染miR20b-5p抑制剂还是转染阴性对照，LIF(10ng/ml)干预组与无LIF干预组比较，EdU阳性细胞率均降低（P＜0.05），但转染miR20b-5p抑制剂后EdU阳性细胞率降低的程度(18％)小于转染阴性对照条件下(29％)。　　结论：　　1、 PVL新生大鼠脑组织中星形胶质细胞数量增加，存在星形胶质细胞反应性增殖。　　2、 PVL新生大鼠脑组织表达LIF蛋白，其表达变化呈先升高后降低的趋势:缺氧缺血后1天时表达增加，3天时达高峰，7天时表达较前下降，14天时降至正常对照组水平，28天时维持低水平表达。LIF mRNA的变化趋势与LIF蛋白一致。PVL新生大鼠脑组织中星形胶质细胞表达LIF。外源性LIF可抑制PVL新生大鼠脑组织GFAP蛋白的表达。　　3、 LIF10ng/ml显著抑制了氧糖剥夺培养诱导的缺氧缺血损伤后星形胶质细胞的增殖。　　4、氧糖剥夺培养诱导的缺氧缺血条件下，大鼠星形胶质细胞miR20b-5p表达下调。抑制miR20b-5p，上调了其靶蛋白VEGF的表达，促进了氧糖剥夺培养诱导的缺氧缺血后星形胶质细胞的增殖。　　5、 LIF通过上调miR20b-5p，进而下调VEGF蛋白的表达，发挥其对氧糖剥夺培养诱导的缺氧缺血后星形胶质细胞增殖的抑制作用。