[背景]鲍曼不动杆菌是一种专性需氧的非发酵革兰阴性杆菌,其分布广泛,是一种临床重要的机会致病菌。目前国内外大多数研究集中在该菌的分类学、流行病学、在临床患者中的感染以及耐药机制,而对其生理及应激机制的研究报道不多。事实上,对鲍曼不动杆菌生理及应激机制的研究是非常重要的,这些基础研究结果,将有助于研究者更好的分析和探讨鲍曼不动杆菌耐药机制、感染机制等关注热点。鲍曼不动杆菌具有极强的适应环境的能力（如耐受干燥、可变的生长需求、生物被膜形成以及群体感应活性等）,这使其在自然环境甚至医院环境中广泛分布且可以长期存活。双组份信号转导系统在鲍曼不动杆菌的环境适应中发挥重要作用,其作为一种将环境改变与细胞生理改变相偶联的策略,是细菌感应外界环境变化并做出反应的重要途径。已有研究表明,鲍曼不动杆菌中的双组份调控系统与细菌的药物敏感性、动力、生物被膜形成能力、菌体形态、毒力等密切相关。通过生物信息学分析,我们发现鲍曼不动杆菌ATCC17978基因组中的AUO97_RS03045基因产物具有四个组氨酸磷酸基转移结构域（HPT）,一个CheA类似调控结构域和C末端的CheY类似接收结构域;AUO97_RS03045很可能编码一个嵌合的双组份调控系统元件,参与鲍曼不动杆菌ATCC17978的趋化信号转导。ChA蛋白所属趋化信号转导系统在其他菌种中的研究结果显示其与细菌的动力相关。大肠杆菌中ChA同源蛋白为CheA,在铜绿假单胞菌中为ChpA,我们将鲍曼不动杆菌中的相应嵌合蛋白命名为ChaA/Y。该系统在大肠杆菌中通过调控鞭毛的旋转方向控制动力,在铜绿假单胞菌中则通过调控IV型菌毛的生物合成及（或）菌毛回缩而参与调控细菌的动力表型。至今在鲍曼不动杆菌中未见该系统相关研究。虽然鲍曼不动杆菌缺乏鞭毛,但其在一定条件下具备运动能力。鲍曼不动杆菌的动力形式多样化,某些表现为“抽搐运动”（twitching）,有些在湿滑的介质表面表现为“滑动”（sliding）或“群集运动”（swarming）,还有些能在半固体琼脂上形成“沟渠”（ditching）。以往的研究表明,鲍曼不动杆菌的动力可能与Ⅳ型菌毛、群体感应、蓝色光传感、铁缺乏和1,3-二氨基丙烷相关。但直到现在,其运动的分子和遗传基础仍不明确的,甚至各种运动形式的定义也不统一。[实验目的]通过研究ChaA/Y双组份调控系统在鲍曼不动杆菌中的调控机制,以期进一步认识该菌的生理代谢过程,了解其一直不明确的动力机制,也能为临床以该系统为靶点开发新的预防及治疗鲍曼不动杆菌感染策略提供实验依据。[实验方法与结果]首先我们采用PCR方法验证了鲍曼不动杆菌ATCC17978的AUO97_RS03045（chaA/Y）、AUO97_RS03050（pil J）、AUO97_RS03055（pil I）、AUO97_RS03060（pil H）、AUO97_RS03065（pil G）基因位于同一个操纵子上共转录,chaA/Y位于该操纵子的末端。利用RecAb系统我们构建了鲍曼不动杆菌ATCC17978的chaA/Y基因敲除株ΔchaA/Y::FRT,消除抗性盒后,仅在原chaA/Y基因位置残余91bp的FRT位点序列;同时,我们利用p MM67EH质粒构建了chaA/Y回补株ΔchaA/Y::FRT-c。然后,我们对野生株ATCC17978、突变株ΔchaA/Y::FRT以及回补株ΔchaA/Y::FRT-c的表型进行观察和比对,主要包括生长状态、代谢实验、表面动力、生物被膜形成、培养上清酰基高丝氨酸内酯（AHL）信号分子含量、药敏实验、透射电镜镜下形态等。表型实验结果显示,chaA/Y基因敲除后,突变株ΔchaA/Y::FRT的表面动力减弱,生物被膜形成能力降低,培养物上清酰基高丝氨酸内酯（AHL）信号分子含量减少,透射电镜下细胞表面菌毛类似物和胞外多聚物减少。野生株与突变株相比,生长状态以及Biolog测试结果无明显差异,对已检测的多种抗生素耐药性也无明显变化,仅对卡那霉素的耐药性增加,ΔchaA/Y::FRT的MIC值为8μg/ml,是野生株的4倍。回补株可以部分恢复表面动力及生物被膜表型。为了明确在鲍曼不动杆菌中受到chaA/Y基因调控的基因,我们利用RNA-sequencing以及实时荧光定量PCR对鲍曼不动杆菌野生株ATCC17978与突变株ΔchaA/Y::FRT在动力平板上生长时的转录组差异进行了研究分析。RNA-sequencing的结果显示,突变株ΔchaA/Y::FRT相比野生株ATCC17978有113个基因显著下调,80个基因显著上调。上调基因富集在泛酸和辅酶A的生物合成代谢通路,芳香族化合物降解,苯甲酸降解,淀粉和蔗糖代谢、脂肪酸的生物合成,乙苯的降解、脂肪酸代谢和氟苯降解代谢通路上。上调最为显著的基因是:AUO97_RS16785（二磷酸核苷糖异构酶）,AUO97_RS16780（酒石酸转运体MFS超家族蛋白）和AUO97_RS16840（主要辅助超家族转运蛋白）。下调基因中与动力和被膜生成可能相关的基因是:CU菌毛（chaperone–usher pili）相关的基因簇（csu A/BABCDE,fim A,fim C,fim D）,AUO97_RS06595-06630操纵子,AUO97_RS06645（aba I）。其中AUO97_RS06595-06630操纵子的转录水平下降最为显著。而与Ⅳ型菌毛相关的基因未见明显改变（以往有研究表明鲍曼不动杆菌的“twitching”动力与Ⅳ型菌毛相关）。实时荧光定量PCR结果验证RNA-sequencing结果可靠。我们通过调研文献发现其中ATCC17978的AUO97_RS06595-06630操纵子和AUO97_RS06645（aba I）已有明确报道和该菌的表面动力及被膜相关。AUO97_RS06595-06630操纵子注释为编码一种酯肽,可能在细菌的运动过程中充当表面活性剂。以往的研究表明,AUO97_RS06595-06630操纵子（以往文献中为A1S₀112-0119操纵子）是鲍曼不动杆菌的生物被膜形成及运动中所必需的。鲍曼不动杆菌的运动和被膜表型可能是通过c AMP的表达与AUO97_RS06595-06630操纵子相关联。另外AUO97_RS06595-06630操纵子还受到aba I基因的调控。aba I基因是鲍曼不动杆菌中唯一的自诱导信号分子合成酶编码基因,编码产物参与合成N-（3-hydroxydodecanoyl）-L-HSL（3-hydroxy-C12-HSL）,一种酰基高丝氨酸内酯（AHL）,是细菌密度感应系统的信号分子。我们在培养基中添加人工合成的AHL信号分子,可以回复ΔchaA/Y::FRT的动力及被膜表型,这说明AHL信号分子在chaA/Y调控过程中发挥重要作用。我们发现CU菌毛（chaperone–usher pili）相关的基因簇在ΔchaA/Y::FRT菌株中显著下调。已有研究表明CU菌毛与鲍曼不动杆菌生物被膜形成相关,而其与动力的关系不明确。因此我们又构建了鲍曼不动杆菌ATCC17978csu E基因敲除株Δcsu E::FRT,测序确认突变株的csu E基因全长从启动子到终止子完全缺失,被91bp的FRT位点取代,并使用pABBR_MCS质粒构建回补株Δcsu E::FRT-c。表型实验结果显示csu E基因敲除后,在相同实验条件下,突变株Δcsu E::FRT的动力减弱,生物被膜形成能力减低,生长状态无明显变化;回补株恢复动力及生物被膜表型。说明CU菌毛受chaA/Y调控,参与鲍曼不动杆菌动力过程。[结论]AUO97_RS03045基因是鲍曼不动杆菌ATCC17978中的一个嵌合的ChaA/Y双组份调控系统元件,参与细菌的趋化信号转导和生物被膜形成。ATCC17978的表面运动能力与以往报道的IV型菌毛的收缩可能无关,其表面运动能力和生物被膜形成与csu A/BABCDE相关CU菌毛及密度感应系统信号分子编码基因aba I调控的AUO97_RS06595-06630操纵子相关,而chaA/Y在鲍曼不动杆菌ATCC17978中也可能是通过这两种机制来调控细菌的表面运动和生物被膜形成的。