干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体,已广泛应用于各种疾病的治疗。干细胞可分为胚胎干细胞,成体干细胞和诱导性多潜能干细胞。成体干细胞由于取材方便,没有伦理学限制和安全性等问题,成为目前临床应用中最主要的干细胞,如:间充质干细胞,造血干细胞等。研究证实成体骨髓、肌肉、脂肪等组织都存在间充质干细胞和造血干细胞,但体内各组织中干细胞比例极低,直接从机体获取干细胞数量非常有限。因此寻找新的干细胞来源或者新的干细胞获取方法是目前国内外干细胞研究的热点,也是临床需要解决的一个难题。本课题组拟利用多孔组织工程材料植入动物体内,探索一种新的、高效的造血干细胞和间充质干细胞获取方法。在前期研究中发现体内埋植多孔组织工程材料方法所捕获细胞中存在造血干细胞,且捕获细胞中贴壁细胞表达间充质干细胞表面标志物,但捕获细胞中是否存在间充质干细胞需要进一步证实,且捕获细胞中造血干细胞和间充质干细胞的比例和应用价值也需要进一步探索。研究目的:1.通过对多孔组织工程材料捕获造血干细胞进行定量分析,并与骨髓中造血干细胞比例进行比较,探索多孔组织工程材料捕获造血干细胞的应用价值。2.证实捕获细胞中间充质干细胞的存在,比较捕获间充质干细胞与骨髓、肌肉间充质干细胞的生物学特性,探索多孔组织工程材料捕获间充质干细胞的应用价值。3.探讨捕获间充质干细胞移植对假肥大型肌营养不良症模型鼠(mdx鼠)的治疗作用。研究方法:1.移植多孔明胶海绵到小鼠后肢大腿内侧肌间隙,分别在3d、6d、9d、12d、15d、18d取出材料,称取海绵重量,计数捕获细胞数。用胎盘蓝拒染法、集落形成细胞检测法等方法检测捕获细胞和骨髓细胞中细胞活力和造血干细胞频率。2.差速贴壁法分离捕获细胞,骨髓和肌肉中的间充质干细胞,用倒置显微镜、成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)检测法、细胞计数、体外诱导分化及细胞染色等方法比较三者的细胞形态、细胞频率、增殖能力和多向诱导分化能力等生物学特性。此外,应用RT-PCR检测捕获间充质干细胞“多能”表面标志物的表达,性染色体标记法初步探索捕获细胞中干细胞的来源。3.将正常雄性C57BL/6小鼠的捕获间充质干细胞和骨髓间充质干细胞肌肉多点注射移植入雌性mdx鼠体内,以未治疗mdx鼠和健康C57BL/6小鼠为对照组。12周后通过强迫游泳实验观察小鼠的运动能力变化,肌肉组织HE染色检测肌肉病理的改变,应用免疫荧光、RT-PCR、Western-blot检测腓肠肌dystrophin蛋白的表达,另进行PCR反应检测移植治疗mdx鼠腓肠肌内sry基因。研究结果:1.第12天时捕获细胞数量达到最大值;捕获细胞的活力明显弱于骨髓细胞(P<0.05);诱导14天后,捕获细胞的造血集落相似于骨髓细胞;但频率和各种克隆的频率均高于骨髓(p<0.05),但两者来源各种造血克隆比比较接近。2.捕获细胞贴壁细胞与骨髓间充质干细胞、肌肉间充质干细胞有相似的细胞形态,增殖能力,骨、软骨和脂肪诱导分化能力,但捕获细胞中CFU-F的比例高于骨髓细胞和肌肉细胞中比例(P<0.05)。此外,捕获间充质干细胞表达“多能”表面标志物rex-1和nanog,而不表达oct-4。捕获细胞中的干细胞可来源于外周循环血。3.捕获间充质干细胞治疗组mdx鼠较未治疗组mdx鼠运动功能似乎有所改善,但没有统计学差异(P>0.05);肌肉病理明显改善,肌纤维核内移明显减少(P<0.05);dystrophin蛋白阳性表达。但与骨髓间充质干细胞治疗效果相比没有统计学差异(P>0.05)。另外,移植治疗的雌性mdx鼠腓肠肌sry基因均为阳性。结论:1.最佳的埋植时间是12天,捕获细胞中的造血干细胞比例高于骨髓,揭示多孔组织工程材料捕获造血干细胞具有较好的应用价值;2.捕获细胞中存在间充质干细胞,比例高于骨髓和肌肉;且捕获间充质干细胞具有部分多能性,揭示多孔组织工程材料捕获间充质干细胞具有较好的应用价值;3.捕获间充质干细胞可以治疗假肥大型肌营养不良症,但需要进一步提高治疗效果。