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2005年,瑞典科学家Tobias Allander等利用随机PCR、高通量测序和生物信息学的方法在下呼吸道被感染的婴幼儿标本中发现一种新病毒,根据序列同源性将其命名为人类博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)。人类博卡病毒是一种二十面体对称的细小病毒,直径18-25nm,无囊膜,基因组以单链线性方式存在,大小约为5500bp。根据目前的分类系统,人类博卡病毒隶属于博卡病毒属,细小病毒亚科,细小病毒科。人类博卡病毒的基因组主要有三个开放阅读框,按5’到3’方向依次编码非结构蛋白NS1、非结构蛋白NP1以及由重叠基因编码的结构蛋白VPl和VP2。病毒感染细胞时,非结构蛋白NS1最先被转录和翻译,病毒基因组的复制和表达需要NS1蛋白的调控。另一个非结构蛋白NP1作为博卡病毒属特有的蛋白,功能还不明确,已有的研究表明其对犬细小病毒(MVC)的DNA复制具有重要作用。本课题根据人类博卡病毒基因组序列(NCBI GeneBank:GU139423)设计多对引物扩增NS1抗原表位(C端1423-2172nt：750bp)、NS1全长、NP1全长基因及NP1截短基因。NP1和NS1全长基因克隆到已成功插入人类博卡病毒启动子HBoV和EGFP基因的pFastBac1供体质粒上,将测序正确的pFB-BoV-EGFP、 pFB-BoV-EGFP-NS1/NP1重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,72h后通过蓝白斑筛选和酚氯仿抽提出正确的重组bacmid并转染Sf9细胞制备所需的重组杆状病毒Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1;NS1抗原表位基因插入原核表达载体pMal-c2x上,IPTG诱导及过柱纯化MBP融合蛋白,最后免疫小鼠制备抗NS1蛋白的多克隆抗体；利用NetPhos2.0Server软件分析NP1蛋白中能磷酸化的氨基酸所对应的碱基,设计引物PCR扩增具磷酸化位点和无磷酸化位点的NP1截短基因,克隆到真核表达载体pEGFP-N1后转染HeLa细胞,48h后荧光显微镜下观察绿色荧光的分布,初步探究NPl蛋白的核定位信号。同时,将NP1截短基因插入另一真核表达载体pCDNA3.1(+)中,为探究NP1蛋白具体功能域做好克隆准备。Bac-BoV-EGFP、Bac-BoV-EGFP-NS1/NP1重组杆状病毒、NS1抗体的制备为探究人类博卡病毒非结构蛋白NS1、NPl的功能提供了丰富的科研材料；初步确定的非结构蛋白NP1在HeLa细胞中的核定位情况为以后进一步研究此蛋白的相关功能提供了参考数据。