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急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)为临床常见危重疾病。尽管临床对急性腺炎的诊疗水平不断提高,但重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)的死亡率仍高达10%-30%。SAP时,大量炎症细胞被过度激活并释放白介素-1、6、10(Interleukin-1、6、10,IL-1、6、10)等炎症因子,从而启动全身炎症反应和调控胰腺组织细胞凋亡。因此在SAP早期控制炎症反应和细胞凋亡,能大大减轻胰腺损伤,提高患者的生存率和改善预后。近年研究发现,传统中药荜茇根部提取物荜拨宁(piperlonguminine,PL)通过影响活性氧簇(Reactive oxygen specie s,ROS)、部分凝血活酶时间和ERK-1/2信号通路等,在修复脑神经损伤、抗凝血活性和抑制肿瘤细胞生长等方面均有调控作用。本课题旨在中医药理论指导下,运用现代分子生物学技术,进行中医药治疗SAP机理及其分子基础的研究,尤其是探讨中药新药-荜拨宁治疗SAP的作用靶点及其可能的相关分子机制,为今后开发新的中医药治疗SAP提供理论依据。目的:建立SAP大鼠模型,探讨中药荜拨根部提取物荜拨宁单体对SAP大鼠的作用及其相关分子机制,为进一步开发该荜拨宁提供实验依据。方法:1动物的分组与处理1.1动物模型的分组:60只SD大鼠按数字表法随机分成假手术(SO)组(10只),模型(SAP)组(10只),荜茇宁(P)组(30只),甲磺酸加贝酯(G M)组(10只)。1.2动物分组后处理:采用逆行胰胆管注射5%牛黄胆酸钠(0.1ml/100g)建立SAP大鼠模型。SO组以生理盐水代替5%牛黄胆酸钠。P组于建模后随机分成低、中、高剂量组(2.5,5,10mg.kg-1)并立即将荜茇宁以腹腔注射形式给药SAP大鼠。GM组建模后立即将甲磺酸加贝酯(gabexate mesilate,GM)(10mg.kg-1)以腹腔注射形式给药SAP大鼠。而SO组和SAP组用等量的生理盐水以腹腔注射形式注入大鼠。12h后处死大鼠留取血清及胰腺组织标本。2实验观察指标2.1第一部分实验观察指标:12h后观察大鼠术后一般状态。随后处死大鼠留取部分胰腺组织干燥箱烤至恒重后检测干湿比重。观察胰腺头部组织病理学大体改变及he染色镜下观改变。紫外分光光度计检测:大鼠血清淀粉酶(amylase,ams)、脂肪酶(lipase,lps)变化。2.2第二部分实验观察指标:紫外分光光度计检测:大鼠血清髓过氧化物酶(myeloperoxidase,mpo)变化。elisa法检测:大鼠血清干扰素-γ(interferon-γ,ifn-γ)、白介素-1(interferon-1β,il-1β)、白介素-10(interferon-10,il-10)和肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor-α,tnf-α)变化。定量pcr检测:胰腺组织tlr-4mrna和nf-κbmrna变化。蛋白质印迹法检测:胰腺组织tlr-4蛋白和nf-κb蛋白表达量变化。2.3第三部分实验观察指标:tunnel染色检测:大鼠胰腺组织细胞凋亡情况。定量pcr检测:peroxiredoxin-4mrna、xbp-1mrna和p38mapmrna表达量变化。蛋白质印迹法检测:peroxiredoxin-4蛋白表达量变化。结果:1实验结果1.1第一部分实验结果:(1)总体上so组大鼠一般状态良好,sap组大鼠状态萎靡,p组及gm组大鼠状态较sap组好转。(2)sap组大鼠血清ams和lps值较so组升高3倍以上。p组、gm组ams和lps水平较sap组下降(p>0.05)。(3)sap组大鼠胰腺组织干湿比重值较so组明显升高(p<0.05)。p组和gm组大鼠胰腺组织干湿比重值较sap组下降(p<0.05)。(4)病理切片大体及镜下结果显示,sap组大鼠胰腺损伤较so组严重。p组和gm组大鼠胰腺损伤较sap组减轻。1.2第二部分实验结果:(1)mpo水平结果显示:sap组大鼠血清mpo表达水平较so组明显升高(p<0.05),p组、gm组较sap组有下降趋势,但差异均没有统计学意义(p>0.05)。(2)elisa结果显示:sap组大鼠血清il-1β、tnf-α和ifn-γ表达水平较so组明显升高(p<0.05,0.01)。p组、gm组IL-1β、TNF-α和IFN-γ表达水平较SAP组均显著降低(P<0.05,0.01);虽SA P组的IL-10表达水平较SO组升高,但无统计学意义(P>0.05)。而P组、G M组IL-10表达水平较SAP组显著升高(P<0.05)。(3)定量PCR结果显示:SAP组大鼠胰腺TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA较SO组表达量明显升高(P<0.05,0.01)。P组、GM组胰腺组织TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA表达量较SAP组显著降低(P<0.05)。(4)蛋白质印迹法结果显示:SAP组大鼠胰腺T LR-4和NF-κB蛋白表达量较SO组明显升高。P组、GM组胰腺组织TLR-4和NF-κB蛋白表达量较SAP组显著降低。1.3第三部分实验结果:(1)TUNNEL染色结果显示:SAP大鼠胰腺细胞凋亡程度较SO组增加。P组和GM组大鼠胰腺组织凋亡程度较SAP组增加。(2)定量PCR结果显示:SAP组大鼠胰腺peroxiredoxin-4 mRNA、XBP-1 mRNA和p38MAPK mRNA表达量较SO组明显升高(P<0.05,0.01)。P组、GM组胰腺组织p38MAPK mRNA表达量较SAP组显著升高(P<0.05),XBP-1 mRN A表达量较SAP组有上升趋势,但差异没有统计学意义(P>0.05),peroxired oxin-4 mRNA蛋白表达量较SAP组显著降低(P<0.05)。(3)蛋白质印迹法结果显示:SAP组大鼠胰腺peroxiredoxin-4蛋白表达量较SO组明显升高。P组、GM组胰腺组织peroxiredoxin-4蛋白表达量较SAP组显著降低。结论:大鼠SAP模型建立成功。荜拨宁能降低AMS、LPS的表达量,抑制SAP相关的炎症因子(IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ)表达、具有缓解SAP病情的作用。其作用机制可能通过调节TLR-4/NF–κB通路和细胞凋亡,而减轻炎症反应。但其对SAP大鼠MPO参与的氧化应激反应及XBP-1参与的内质网应激细胞凋亡通路的影响未见统计学意义,尚需更长治疗时间观察明确。