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第一部分 长链非编码RNAMIR4435-1HG在肾癌中的表达及临床意义目的:发现肾癌中异常表达的长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA),并探索其表达水平与肾癌临床病理的关系以及对于预后的影响。方法:选取临床3对肾癌标本及其癌旁组织,通过Human LncRNAOneArray Plus表达谱基因芯片(北京六合华大基因技术有限公司)检测肾癌及癌旁组织中的lncRNA表达水平。入组并收集手术切除的肾透明细胞癌及癌旁标本,所有病例的病理结果经病理学确诊均为透明细胞癌。对于芯片发现的异常表达的lncRNA做Go分析,并通过组织、细胞验证其表达水平。术后随访肾癌患者了解预后情况。细胞株及组织分别行RNA提取及PCR检测。数据使用SPSS Statistics 16.0分析。结果:lncRNA芯片分析显示肾癌与癌旁组织之间有明显区别的lncRNA表达。在肾癌中上调的lncRNAs中,发现MIR4435-1HG在肾癌组织中的表达程度明显高于在癌旁组织中的表达。Go分析结果显示如下:MIR4435-1HG位于线粒体或者细胞内膜,主要参与PI3K-Akt信号通路、microRNAs在肿瘤中的调控,并与细胞凋亡途径有关。本研究入组肾透明细胞癌病例共55例。配对癌旁组织的肾癌标本55例提取RNA后PCR检测MIR4435-1HG表达水平。MIR4435-1HG在肾癌组织中的表达水平高于在癌旁组织中的表达水平。MIR4435-1HG在不同性别患者肾癌组织中的表达水平无统计学差异,p=0.113。MIR4435-1HG在不同年龄患者肾癌组织中的表达水平无统计学差异,p=0796。在Fuhrman分级3+4级肾癌组织中MIR4435-1HG的表达水平高于在Fuhrman分级1+2级肾癌组织中的表达水平;p<0.001。MIR4435-1HG在肿瘤大小≥50mm肾癌组织中的表达水平高于在肿瘤大小<50mm肾癌组织中的表达水平,p=0.0415。MIR4435-1HG在T2-4N0-1M0-1肾癌组织中的表达水平高于在T1N0M0肾癌组织中的表达水平,P<0.001。MIR4435-1HG高表达组患者的无复发生存时间短于MIR4435-1HG低表达组,p=0.028。MIR4435-1HG高表达组患者的总生存时间相较MIR4435-1HG低表达组患者的总生存时间无统计学差异,p=0.127。接受者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC curve)由 SPSS 绘制,MIR4435-1HG 的 ROC 曲线下面积为 0.946(95%置信区间:0.906-0.986)。结论:MIR4435-1HG是在肾癌组织中异常表达的长链非编码RNA,其表达水平相比癌旁组织明显偏高。在肾癌中,MIR4435-1HG的表达水平与病例的年龄、性别无关,而与肿瘤的分级、临床分期和肿瘤大小均有关。高表达MIR4435-1HG提示肾癌患者不良预后。MIR4435-1HG可以作为具有诊断价值的生物标志物。MIR4435-1HG在肾透明细胞癌的发生可能起到致癌的作用,并作为临床上肾癌预后判断新的指标。第二部分 长链非编码RNAMIR4435-1HG在肾癌细胞中的生物学功能目的:为探索长链非编码RNAMIR4435-1HG对肾癌细胞生物学行为的影响,在此部分中本课题通过体外实验探究了 MIR4435-1HG的生物学功能。方法:过表达(overexpression,OE)和敲减(knockdown,KD)慢病毒载体构建由吉凯基因公司完成。肾癌细胞系和正常对照细胞系均购自中科院细胞库,HK-2、786-0、OSRC-2细胞复苏后培养基培养。过表达和敲减效率验证,并确立后续使用的慢病毒。细胞处理后抽提RNA、逆转录和PCR。细胞增殖实验选用CCK-8试剂盒检测。细胞克隆检测并计数。细胞凋亡检测及细胞周期检测均采用流式细胞术。细胞transwell实验检测细胞侵袭和迁移。结果:RT-PCR验证慢病毒对MIR4435-1HG表达的影响效率,过表达病毒转染后MIR4435-1HG表达水平较阴性对照(negative control,NC)组显著提高。两种敲减慢病毒感染细胞株,其中70153-1组MIR4435-1HG表达水平较NC组显著下降,后续我们选用其作为慢病毒用于下调MIR4435-1HG表达。CCK-8法检测MIR4435-1HG对细胞增殖能力:相比对照组NC,KD组细胞增殖率降低,p<0.05;相比对照组NC,OE组细胞增殖率提高,p<0.05,具有统计学意义。克隆形成实验统计结果表明:在三种细胞系中,慢病毒感染后,相对于对照NC组,KD组细胞克隆形成计数明显减少,结果有统计学差异(p<0.05);相对于对照NC组,OE组细胞克隆形成计数明显增加,结果有统计学差异(p<0.05)。细胞周期检测结果显示在三种细胞株中,相对于对照组NC组,KD组G0/G1期的细胞比例显著升高,S期的细胞比例显著降低,差异具有统计(p<0.01);相对于对照NC组,OE组G0/G1期的细胞比例显著降低,S期的细胞比例显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪检测MIR4435-1HG对肾癌细胞凋亡的影响:相对于对照组NC组,KD组凋亡细胞比例显著升高,差异具有统计(P<0.01)。相对于对照NC组,OE组凋亡细胞比例显著降低,差异具有统计(p<0.01)。Transwell实验:侵袭方面,过表达MIR4435-1HG的OE组细胞穿过含基质胶的transwell的细胞数大于NC组;敲减MIR4435-1HG表达的KD组穿过含基质胶的transwell的细胞数少于NC组(p<0.01)。迁移能力方面,OE组transwell下层的细胞数大于NC组,KD组transwell下层的细胞数少于NC组(P<0.01)。结论:MIR4435-1HG敲减和过表达影响肾癌细胞中的生物学功能。MIR4435-1HG敲减导致细胞增殖的减少、细胞克隆形成减少,细胞周期停滞在G0/G1,诱导肾癌细胞凋亡,而且细胞侵袭、迁移能力显著减弱。相反,过表达MIR4435-1HG导致细胞增殖的增加、细胞克隆形成的增加,细胞周期S期比率增高提示DNA复制,肾癌细胞凋亡减少,而且侵袭、迁移能力显著增强。为了支持体外研究结果,我们后续将在体内动物研究进一步证实;并通过对MIR4435-1HG与蛋白相互作用关系探索其影响细胞增殖凋亡的分子机制。第三部分 长链非编码RNAMIR4435-1HG影响肾癌细胞生物学行为的机制研究目的:发现长链非编码RNAMIR4435-1HG影响肾癌细胞生物学行为的分子机制。方法:探针设计合成、荧光原位杂交技术检测长链非编码RNAMIR4435-1HG在细胞内的定位。标记生物素RNA探针,然后采用RNA pulldown技术分离获得蛋白。质谱鉴定(LC-MS/MS)检测得到的蛋白。提取细胞株的蛋白并Western blot验证质谱结果以及其他特异性蛋白。结果:荧光原位杂交技术结果显示:18S及U6分别定位细胞质和细胞核,MIR4435-1HG目的序列则在细胞质及细胞核中均有表达存在,且细胞质中含量相对较高。RNA Pulldown将sense和antisense所有蛋白同时进行质谱鉴定,从鉴定分析结果中进行比对,找出sense特有的蛋白即互作蛋白,主要有抗苗勒管激素(Muellerian-inhibiting factor,AMH);丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase,PC);蛋白水解诱导因子(Dermcidin,DCD);78 kDa葡萄糖调节蛋白(78 kDa glucose-regulated protein,GRP);甲基丁烯酰辅酶 A 羧化酶(Methylcrotonoyl-CoA carboxylasebeta chain,MCCC2)。对BCL2L11(BCL2-like 11)这种凋亡相关蛋白进行检测结果发现,在MIR4435-1HG敲减后,BCL2L11表达水平较NC组升高;在MIR4435-1HG过表达后,BCL2L11表达水平较NC组降低。除了 MCCC2因为抗体购买困难未进行验证,我们针对其余四种RNA Pulldown蛋白均作了后续的WB测定。在MIR4435-1HG敲减后,PC表达低于NC组。而在MIR4435-1HG过表达后的细胞株,PC表达高于NC组。其余三个蛋白目前未发现显著差异。此外,针对NICD1这个重要的肿瘤相关蛋白进行了蛋白检测,结果发现在MIR4435-1HG敲减后的细胞株,其NICD1表达水平低于对照组;而在MIR4435-1HG过表达后的细胞株,其NICD1表达水平高于对照组。结论:MIR4435-1HG在细胞内主要定位于细胞质,提示MIR4435-1HG主要在转录后水平发挥作用。MIR4435-1HG的抑制和过表达能够影响细胞凋亡,主要通过BCL2L11实现。MIR4435-1HG主要与以下蛋白质发生相互作用:AMH、PC、DCD、GRP、MCCC2。研究结果证实了 MIR4435-1HG与PC之间确实存在调控的关系。此外,MIR4435-1HG还调控NICD1的表达水平。本研究的发现有助于较为全面地解释了 MIR4435-1HG在肾癌细胞中发挥作用的机制。第四部分 长链非编码RNAMIR4435-1HG对肾癌细胞在裸鼠体内增殖的影响目的:发现长链非编码RNAMIR4435-1HG在动物体内实验中对肾癌的作用。方法:SPF级BALB/c裸鼠,购于上海斯莱克实验动物中心。收集转染了敲减病毒或者NC的786-0细胞株。计数并制备,每只裸鼠皮下注射。每组8只裸鼠。每7天测量一次肿瘤长与宽,共4次。一个月后处死裸鼠并取肿瘤组织并称重。结果:发现裸鼠皮下移植瘤体积随时间改变。第一周检测两组间皮下移植瘤体积无显著差异,而实验组皮下移植瘤在第二、第三、第四周测量时均小于对照组的瘤子大小,p<0.001。四周后,人道处死裸鼠,取出裸鼠的肿瘤,测量大小,并称重,结果显示实验组的瘤子体积为116.8±56.75mm3,对照组瘤子长径为381.4±104.1mm3,实验组的瘤子大小明显小于对照组的瘤子大小,p<0.001;实验组的瘤子重量0.55±0.05g,对照组的瘤子重量1.17±0.04g,实验组的瘤子重量小于对照组的瘤子重量,p<0.001。结论:通过裸鼠皮下移植瘤实验,证实了 MIR4435-1HG的抑制确实能够抑制肾癌在体内的生长,提示MIR4435-1HG作为肾癌治疗靶向具有一定的前景。