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杆状病毒表达载体利用杆状病毒极晚期基因启动子多角体基因(polh)或p10基因的启动子,能高效地表达外源蛋白。且杆状病毒-昆虫细胞表达系统能进行蛋白翻译后修饰,因此被广泛用于表达具有生物活性的蛋白质。但在实际应用中很多蛋白的产量并不理想,因此,我们希望构建一个更为高效的杆状病毒表达载体,为蛋白质结构功能的研究提供一个新型的更为有力的研究工具。本研究先敲除AcMNPV Bacmid上的几丁质酶基因(Chitinase,chiA)和组织蛋白酶基因(v-cathepsin,v-cath),同时在敲除的位点插入rpsL-AMP片段,为后续的反筛实验奠定基础。随后,将表达Sf-caspase-1全长双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)的序列构建到pBac5上,与AcMNPV Bacmid共转染Sf9细胞,得到重组杆状病毒vAcMNPV-dsCasp。结果表明,重组杆状病毒vAcMNPV-dsCasp感染细胞后会使细胞中Sf-caspase-1 mRNA的含量下降,而抑制细胞凋亡。此外,我们根据Sf-caspase-1序列分别设计了三个shRNA(short hairpin RNA),用来干扰Sf-caspase-1基因的表达。先在pTriExGFP上分别构建了三段表达Sf-caspase-1shRNA的基因序列,再与AcMNPV Bacmid共转染Sf9细胞,得到的重组杆状病毒vAc MNPV-124/422/783,这些重组病毒能表达sh RNA,干扰Sf-caspase-1基因,从而抑制Sf9细胞凋亡。PI染色检测Sf9细胞凋亡,结果表明124片段抑制Sf9细胞凋亡效果最明显。为了构建能表达Sf-caspase-1 shRNA的杆状病毒载体,把表达Sf-caspase-1shRNA的反向互补序列反筛到AcMNPV Bacmid骨架上构成AcMNPV Bacmid-124/422/783,并与pTriEx-Fluc共转染Sf9细胞产生重组病毒。本实验通过表达Sf-caspase-1 shRNA或全长dsRNA干扰Sf-caspase-1基因的表达,检测其抑制Sf9细胞凋亡效果。并把表达Sf-caspase-1 shRNA的反向互补序列敲入到AcMNPV bacmid骨架上,使得在表达外源蛋白的同时能够抑制Sf9细胞凋亡并延长蛋白表达时限。