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重金属污染一直未能得到有效的控制,生物修复的方法不仅省时,节能,环境友好,成本低,还可回收重金属,是一种极具应用价值的重金属污染修复方法。莱茵衣藻一直是生物学界的模式生物,作为模型被用于细胞水平过渡金属动态平衡和耐受的生理学、生物化学和分子遗传学研究。鉴定莱茵衣藻过渡金属离子转运蛋白的功能和特异性,能够为进一步深入研究不同细胞区隔的金属离子分布需求、金属离子浓度调控途径、金属离子与其它微量元素的相互关系等工作打下基础,也能够提供大量的调控金属富集程度的靶基因,从而可以为高效率低成本污染水体和土壤的生物修复提供方案。此外,还可以为莱茵衣藻进行生物生产提供理论基础。本文主要对NRAMP1转运蛋白进行功能分析,并预测了NRAMP家族转运Cd(Ⅱ),Co(Ⅱ),Zn(Ⅱ)的模式和ZIP家族的转运Zn(Ⅱ)的模式。首先通过分段式扩增再进行overlap PCR重组的方法,成功扩增出GC含量高达70%的莱茵衣藻NRAMP1基因。其次利用生物信息学分析,将与Cr NRAMP1蛋白亲缘关系最近的Os NRAMP7蛋白,At NRAMP6蛋白转运功能相关的Zn(Ⅱ),Fe(Ⅲ),Cd(Ⅱ),Mn(Ⅱ)列为研究莱茵衣藻NRAMP1蛋白特异性转运底物的候选者。进一步地,构建了酵母细胞核转化所需的空载p Sc-EV和NRAMP1过表达质粒p Sc-NRAMP1,并将其分别转入酵母野生型BY4741,YCF1基因缺失突变株和SMF1基因缺失突变株中,共得到6株转基因酵母。并且,构建了莱茵衣藻细胞核转化所需的空载p Cr-EV和NRAMP1过表达质粒p Cr-NRAMP1,并将其转入莱茵衣藻野生型CC4533中,得到了一株对照藻株和三株过表达藻株。通过对莱茵衣藻野生型CC4533和NRAMP1基因缺失突变株nramp1△进行生长分析,筛选出了可能是NRAMP1转运蛋白的特异性转运底物的候选金属离子:Cd(Ⅱ),Co(Ⅱ),Zn(Ⅱ)。同时也获知:Zn(Ⅱ),Mn(Ⅱ),Fe(Ⅲ)作为莱茵衣藻生长所必须的微量元素,仅需极少量的Zn(Ⅱ)就可维持其正常生长;而莱茵衣藻的生长对Mn(Ⅱ)敏感,偏高或偏低都会对莱茵衣藻的生长产生明显抑制;莱茵衣藻生长过程中虽然对Fe(Ⅲ)缺失敏感,但对Fe(Ⅲ)浓度的增加耐受度非常高。通过金属离子生长胁迫分析酵母转基因菌株和莱茵衣藻转基因藻株,辅以NRAMP家族和ZIP家族的相对表达量分析,获知:NRAMP1特异性转运底物之一为Zn(Ⅱ),其可能定位在细胞膜上,转运Zn(Ⅱ)方向为由外向内,或定位在液泡膜上,转运Zn(Ⅱ)方向为由内向外;NRAMP1与Co(Ⅱ)转运相关,并可能与NRAMP4共同作用于Co(Ⅱ)运入细胞,NRAMP4可能在Co(Ⅱ)的解毒机制中发挥重要的调控作用,NRAMP4可能还负责将Co(Ⅱ)运出细胞。NRAMP2的表达可能不受Cd(Ⅱ),Zn(Ⅱ),Co(Ⅱ)的调控,并且NRAMP2有可能拥有与NRAMP1相反的功能,有拮抗作用。NRAMP3可能在莱茵衣藻的金属解毒机制发挥功能,作用之一为减少Cd(Ⅱ),Zn(Ⅱ),Co(Ⅱ)在莱茵衣藻细胞内的累积,有可能定位在液泡膜上,将这些金属离子贮存在液泡内,也有可能定位在细胞膜上,将过多的金属运出莱茵衣藻。ZRT1,ZRT4和ZIP6的表达可能与NRAMP1没有相关性。ZRT1在Zn(Ⅱ)转运中的作用是有利于莱茵衣藻细胞内的Zn(Ⅱ)累积以提供其生长所需的微量元素;ZRT4在Zn(Ⅱ)进出莱茵衣藻细胞时均发挥作用;ZIP6可能在Zn(Ⅱ)的转运中并未起到关键作用,可能是其他转运蛋白转运Zn(Ⅱ)的辅助因子。