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过去的几十年来,玻璃化冷冻生物学已经取得巨大进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率也越来越高,但胚胎冻存后往往不可避免地会受到一定程度的损伤,特别是线粒体(mitochondria)损伤。线粒体是胚胎的能量工厂,通过氧化磷酸化为胚胎的发育提供能量。与细胞内部不同区域能量需求所匹配的线粒体分布和状态,对于小鼠2-细胞胚胎的后续发育至关重要。同时,线粒体还与胚胎中活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的生成与清除、胚胎的氧化应激密切相关。因此,线粒体的功能损伤或分布异常会严重影响胚胎发育。白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂,目前认为其能够激活线粒体的生物合成并保护线粒体。因此我们假设白藜芦醇处理玻璃化冷冻保存胚胎可能会对玻璃化冷冻诱发的线粒体损伤产生有利影响。本研究首先检测了尼龙网法玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎可能造成的线粒体损伤,在此基础上研究白藜芦醇能否修复玻璃化冷冻造成的线粒体损伤及其机制,以期对人类医学和动物生产中卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻技术的进一步研究提供借鉴。研究内容和结果如下:(1)利用尼龙网法玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎,检测玻璃化冷冻-解冻对胚胎造成的线粒体损伤。新鲜组和玻璃化冷冻-解冻组小鼠2-细胞胚胎培养2 h后,检测线粒体分布、线粒体膜电位(ΔΨm)以及细胞内ROS水平。结果显示,新鲜胚胎中线粒体均匀分布于细胞质中,在细胞核周围有环绕聚集现象;而大部分玻璃化冷冻-解冻后胚胎,线粒体在细胞质中不规律聚集分布;新鲜胚胎的线粒体膜电位显著高于玻璃化冷冻-解冻胚胎(P<0.05),新鲜胚胎的ROS水平显著低于玻璃化冷冻-解冻胚胎(P<0.05)。这表明玻璃化冷冻造成了小鼠2-细胞胚胎线粒体的分布异常和功能损伤。(2)新鲜组小鼠2-细胞胚胎,分别在添加不同浓度白藜芦醇(0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L)的培养液中体外培养72 h;玻璃化冷冻-解冻组小鼠2-细胞胚胎,分别在添加不同浓度白藜芦醇(0.01μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L)的培养液中体外培养72 h;筛选小鼠胚胎培养中白藜芦醇处理的适宜浓度,并以囊胚发育率和囊胚细胞计数评价胚胎发育情况和胚胎质量。结果显示,白藜芦醇浓度为0.1μmol/L时,新鲜组和玻璃化冷冻-解冻组胚胎的囊胚发育率最高、囊胚质量最好,后续试验以0.1μmol/L白藜芦醇为适宜处理浓度。(3)基于上述研究结果,对新鲜胚胎溶剂对照组和白藜芦醇(0.1μmol/L)共培养组,玻璃化冷冻-解冻胚胎溶剂对照组和白藜芦醇(0.1μmol/L)共培养组等四组小鼠2-细胞胚胎培养72 h,检测胚胎线粒体生物合成和功能相关基因SIRT1和PGC-1αmRNA表达水平。结果显示,白藜芦醇共培养组胚胎SIRT1和PGC-1αm RNA水平显著低于未共培养组胚胎(P<0.05)。据此我们推测,白藜芦醇共培养组胚胎的SIRT1和PGC-1αmRNA水平低于未共培养胚胎的可能原因是,经过玻璃化冷冻-解冻后的小鼠2-细胞胚胎,在72 h的体外培养过程中,白藜芦醇在胚胎进入培养的最初阶段,已经完成对线粒体损伤的修复,胚胎在之后的发育中已经不需要SIRT1和PGC-1α的高表达来进一步改善线粒体生物学功能。(4)根据上述研究结果和理论推测,我们进一步检测上述四组2-细胞胚胎与白藜芦醇共培养8 h后,SIRT1和PGC-1αmRNA的表达水平。结果显示与白藜芦醇共培养8 h的胚胎SIRT1和PGC-1αmRNA表达水平与未共培养组的胚胎相似,说明玻璃化冷冻后的胚胎在经过2-细胞胚胎发育到4-细胞胚胎的这一卵裂周期内,白藜芦醇可能已经基本完成了其修复线粒体损伤的作用。因此我们将玻璃化冷冻-解冻后与白藜芦醇共培养8 h的胚胎继续培养到72 h,统计其囊胚发育率,结果显示白藜芦醇共培养组胚胎囊胚发育率显著高于未共培养的胚胎(P<0.05),且与新鲜组胚胎之间无显著性差异(P>0.05),进一步说明与白藜芦醇共培养8 h、胚胎已经完成下一个卵裂周期发育到4-细胞阶段,白藜芦醇已经基本完成了其修复胚胎冷冻-解冻所造成的线粒体损伤的作用,能够保证冷冻-解冻胚胎的后续发育。(5)根据上述研究结果,同时考虑到与白藜芦醇长时间共培养可能会对胚胎发育产生一定程度的毒性作用,我们进一步探索缩短白藜芦醇对玻璃化冷冻-解冻后小鼠2-细胞胚胎的处理时间,能否恢复玻璃化冷冻-解冻胚胎的线粒体正常分布及其生物学功能。继续对上述研究中四个培养组的2-细胞胚胎培养2 h,检测SIRT1和PGC-1αmRNA表达水平,转入常规培养液继续培养至72 h的囊胚发育率,以及共培养2 h时2-细胞胚胎的线粒体分布、ROS水平和线粒体膜电位。结果表明,四组胚胎在培养2 h后,白藜芦醇处理组胚胎的SIRT1和PGC-1αmRNA水平显著高于未共培养组胚胎(P<0.05),这表示从mRNA水平上来说,在共培养的2 h时白藜芦醇已经激活了线粒体的生物合成并提高了线粒体的功能;玻璃化冷冻-解冻后小鼠2-细胞胚胎与白藜芦醇共培养2h后,转入常规培养液继续培养至72 h的囊胚发育率显著高于未共培养的胚胎(P<0.05),且与新鲜组胚胎之间无显著性差异(P>0.05),这表示在共培养的2 h内白藜芦醇修复了冷冻造成的线粒体损伤并可能达到了与新鲜胚胎相似的发育能力;玻璃化冷冻-解冻后与白藜芦醇共培养2 h的小鼠2-细胞胚胎,其线粒体分布情况与新鲜胚胎中线粒体的分布情况相似,即均匀地分布于细胞质中,在细胞核周围有规律的环状聚集现象;而未共培养组玻璃化冷冻-解冻小鼠2-细胞胚胎,线粒体在细胞质中分布仍不均匀,细胞核周围有大量积聚的现象;玻璃化冷冻-解冻后胚胎中ROS水平显著高于新鲜胚胎(P<0.05),而白藜芦醇共培养2 h的胚胎ROS水平显著低于未共培养的冷冻胚胎(P<0.05),达到与新鲜胚胎类似的水平;玻璃化冷冻-解冻后胚胎线粒体膜电位显著低于新鲜胚胎(P<0.05),而白藜芦醇共培养2 h的胚胎线粒体膜电位显著高于未共培养的冷冻胚胎(P<0.05),并达到与新鲜胚胎相似的水平。这些检测结果都表明,白藜芦醇共培养2 h能够明显起到修复玻璃化冷冻所致线粒体损伤的作用。上述结果表明,玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎造成了显著的线粒体分布异常和线粒体功能的损伤,而玻璃化冷冻-解冻后的胚胎,经过与白藜芦醇共培养2 h,线粒体分布异常和功能损伤得到明显的改善;并且胚胎的后续发育能力明显优于玻璃化冷冻-解冻后未共培养的胚胎。